蘭明先,張 某,李建一,魯武鋒,李召波,夏 濤,李麗芳,吳國(guó)星,高 熹

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

紫莖澤蘭EupatoriumadenophorumSpreng屬菊科澤蘭屬,為多年生惡性雜草,具較強(qiáng)的入侵性。紫莖澤蘭可分泌許多克生物質(zhì)抑制其它植物生長(zhǎng),快速侵占草地牧場(chǎng)、田間林地、山谷河流,給入侵地造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。紫莖澤蘭所含的很多植物次生物質(zhì)如澤蘭素A和內(nèi)酯等對(duì)很多種類的昆蟲(chóng)有較強(qiáng)的化感作用[1-3]。因此,大多數(shù)昆蟲(chóng)都拒食或避忌紫莖澤蘭,僅澤蘭實(shí)蠅ProcecidocharesutilisStone專性取食紫莖澤蘭。

澤蘭實(shí)蠅是雙翅目實(shí)蠅科昆蟲(chóng),是紫莖澤蘭的天敵昆蟲(chóng),其幼蟲(chóng)專性取食紫莖澤蘭莖稈的幼嫩部分,使紫莖澤蘭莖稈膨大形成蟲(chóng)癭,對(duì)其生長(zhǎng)及繁殖均有一定的抑制作用[4-6]?，F(xiàn)在已經(jīng)有很多國(guó)家和地區(qū)利用澤蘭實(shí)蠅對(duì)紫莖澤蘭進(jìn)行防治[7-8]。在20世紀(jì)80年代,澤蘭實(shí)蠅越過(guò)喜馬拉雅山脈,擴(kuò)散并成功定殖在西藏聶拉木縣,由此傳入我國(guó)[9]。為了防治紫莖澤蘭,云南省昆明市從西藏的聶拉木縣引入澤蘭實(shí)蠅,后來(lái)該蟲(chóng)逐步擴(kuò)散到云南省的大部分地區(qū)、四川的西南部地區(qū)、貴州以及廣西等省份[10-11]。

澤蘭實(shí)蠅食物中的營(yíng)養(yǎng)成分均來(lái)自紫莖澤蘭,在澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)取食的同時(shí)也攝入了大量的有害次生物質(zhì),然而幼蟲(chóng)并未中毒,由此說(shuō)明澤蘭實(shí)蠅對(duì)紫莖澤蘭的毒素物質(zhì)有一定的耐受或者降解作用。有研究表明,共生菌的生長(zhǎng)可以對(duì)植物的生理進(jìn)行調(diào)控,抑制植物合成一些對(duì)昆蟲(chóng)有不利影響的物質(zhì),從而增強(qiáng)昆蟲(chóng)的抗逆性[12-18];昆蟲(chóng)內(nèi)共生菌還可對(duì)宿主昆蟲(chóng)所攝取的植物次生物質(zhì)(如生物堿、氰苷等)進(jìn)行解毒作用,例如蘋果繞實(shí)蠅(Rhagoletispomonella)中的聚團(tuán)腸桿菌(Enterobacteragglomerans)可以將植物源有毒物質(zhì)根皮苷降解脫毒,有利于蘋果繞實(shí)蠅的存活[19]。在澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)同樣有共生菌的生長(zhǎng),共生菌在協(xié)助其宿主營(yíng)養(yǎng)代謝的過(guò)程中,可能也有一定的解毒作用。但在目前澤蘭實(shí)蠅共生菌的研究中,僅對(duì)澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)的腸道細(xì)菌有初步的研究,還沒(méi)有系統(tǒng)地對(duì)澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研究[20]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)傳統(tǒng)的分離鑒定與16S rDNA序列分析相結(jié)合的方法分離鑒定了澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的種類,并通過(guò)圓葉片法初步研究了內(nèi)生細(xì)菌的除草活性,旨在為明確澤蘭實(shí)蠅對(duì)紫莖澤蘭的解毒機(jī)制提供科學(xué)依據(jù),也為更有效地控制紫莖澤蘭奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

澤蘭實(shí)蠅老熟幼蟲(chóng)采自昆明市呈貢區(qū)及本實(shí)驗(yàn)室所種植的紫莖澤蘭蟲(chóng)癭內(nèi)。

1.2 研究方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 對(duì)采回的蟲(chóng)癭進(jìn)行整體消毒后在超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖出澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng),將幼蟲(chóng)體表滅菌后解剖,獲得體內(nèi)各組織[21]。分別收集所獲得的各組織于離心管內(nèi),研磨后梯度稀釋制備菌懸液。取10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液各0.1 mL,分別接種在NA培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)[22]。將接菌后的培養(yǎng)皿倒置,于28 ℃培養(yǎng)2 d[23]。待長(zhǎng)出單菌落后,進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化3～4次可得純化后的菌株[24]。

1.2.2 菌落特征的觀察 挑取純化后的單菌落，在LB培養(yǎng)基平板上劃線接種,于28 ℃培養(yǎng)2 d,待長(zhǎng)出單菌落后觀察其形態(tài)[25]。

1.2.3 菌體形態(tài)的觀察 挑取純化后的單菌落，在LB培養(yǎng)基平板上劃線接種,于28 ℃培養(yǎng)2 d,獲得單菌落。挑取單菌落涂布于載玻片上,做革蘭氏染色[26]。將做好的玻片放在油鏡下觀察菌體的形態(tài),測(cè)定菌體的大小,并記錄革蘭氏染色結(jié)果。

1.2.4 生理生化測(cè)定 將分離純化出來(lái)的菌株做細(xì)菌的生理生化實(shí)驗(yàn)[27]。

1.2.5 16S rDNA的擴(kuò)增和測(cè)序 將所純化分離的細(xì)菌做16S rDNA基因序列鑒定。對(duì)根據(jù)形態(tài)特征歸類的微生物類群,用試劑盒提取代表性單菌落的DNA,具體方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)。將提取的DNA用于細(xì)菌高變動(dòng)區(qū)段V4區(qū)的體外擴(kuò)增，引物為16S V4區(qū)通用引物[28]。回收純化PCR產(chǎn)物,與pJET載體連接,進(jìn)行BJIⅡ酶切鑒定。用基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物對(duì)(515F和608R)擴(kuò)增到400 bp左右的基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)及核糖體DNA基因片段。由昆明擎科生物公司對(duì)16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序,對(duì)所得序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.6 共生菌對(duì)紫莖澤蘭葉片的影響 共生菌對(duì)紫莖澤蘭葉片影響的測(cè)定采用葉圓片法。選取紫莖澤蘭植株固定部位大小一致的葉片,在清水里沖洗一段時(shí)間；取出葉片晾干,用30%過(guò)氧化氫對(duì)葉表面滅菌。將滅菌后的濾紙平鋪于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi),實(shí)驗(yàn)組加入5 mL于搖床培養(yǎng)24 h的菌懸液,對(duì)照組加入5 mL的無(wú)菌水。用直徑為6 mm的打孔器打取紫莖澤蘭葉圓片,將葉背面向上平放于鋪有濾紙、裝有5 mL菌懸液或無(wú)菌水的培養(yǎng)皿內(nèi),用保鮮膜封口后置于(25±2)℃、L∶D=12 h∶12 h的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每隔24 h統(tǒng)計(jì)一次結(jié)果。采用分級(jí)統(tǒng)計(jì)方法記錄紫莖澤蘭葉圓片的受害情況。評(píng)價(jià)菌懸液對(duì)葉圓片侵害程度的標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[29]。侵害指數(shù)的計(jì)算公式如下：

表1 評(píng)價(jià)菌懸液對(duì)葉圓片侵害程度的標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

通過(guò)分離純化澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)的內(nèi)生細(xì)菌,共獲得22株細(xì)菌,將其標(biāo)號(hào)為ZLSY1～ZLSY22,并進(jìn)行菌落特征觀察記錄,將結(jié)果列于表2。

2.2 菌體的形態(tài)特征

對(duì)所分離的22株菌在10×100倍油鏡下進(jìn)行菌體特征及革蘭氏染色結(jié)果的觀察,結(jié)果如表3。由表3可知：有9株菌產(chǎn)芽孢；僅有4株菌為圓球形或者橢球形,其余18株菌均為桿菌；有13株菌為革蘭氏陽(yáng)性菌,有9株菌為革蘭氏陰性菌。

2.3 生理生化特性

由表4可知:在22株菌中,有7株菌能分泌淀粉水解酶水解淀粉;有2株菌能水解油脂;有19株菌在石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生反應(yīng);在明膠液化實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生反應(yīng)的有16株菌;有8株菌不水解硫化氫,反應(yīng)結(jié)果為陰性。在葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的有3株菌,只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的有3株,其余均既不產(chǎn)酸又不產(chǎn)氣;在乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，僅有1株菌既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣,有2株既不產(chǎn)酸又不產(chǎn)氣,剩余19株菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；在吲哚實(shí)驗(yàn)中,有10株菌呈陽(yáng)性反應(yīng);在甲基紅實(shí)驗(yàn)中有7株菌呈陽(yáng)性反應(yīng);在伏-普實(shí)驗(yàn)中有9株菌呈陽(yáng)性反應(yīng);在檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)中有8株菌可以使其變色而呈陽(yáng)性反應(yīng)。

表2 澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的菌落特征

表3 澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的菌體特征及革蘭氏染色結(jié)果

2.4 16S rDNA序列分析

對(duì)分離純化后的22株菌進(jìn)行16S rDNA序列分析,結(jié)果如表5。表5所列是所擴(kuò)增的片段與GenBank中已發(fā)表的細(xì)菌基因序列的同源性均在98%以上的基因序列。從分子水平鑒定了所分離的細(xì)菌種類,在所分離的22株澤蘭實(shí)蠅內(nèi)生細(xì)菌中，有1株菌未被鑒定出來(lái)，其余21株菌隸屬10個(gè)屬,分別為迪茨菌屬(Dietzia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、泛菌屬(Pantoea)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、莫拉菌屬(Moraxella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、克呂沃爾菌屬(Kluyvera)。其中6株菌屬于泛菌屬,5株菌屬于芽孢桿菌屬,3株菌屬于類芽孢桿菌屬,其余屬均只有1株菌。

表4 澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌主要生理生化特性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注:“A”表示既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣;“B”表示只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;“C”表示既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣;“+”表示陽(yáng)性反應(yīng);“-”表示陰性反應(yīng)。

表5 澤蘭實(shí)蠅內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列分析結(jié)果

2.5 共生菌對(duì)紫莖澤蘭葉片的作用

所分離純化的22株菌經(jīng)初步篩選有6株菌在實(shí)驗(yàn)中效果很明顯,其余菌株無(wú)作用。這6株菌分別為ZLSY2、ZLSY5、ZLSY15、ZLSY16、ZLSY20、ZLSY22。由圖1可以看出，這6株菌與對(duì)照組之間的侵害效果均有顯著差異,但各株菌之間差異不顯著。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,6株菌對(duì)紫莖澤蘭葉片的侵害程度均呈上升趨勢(shì),在72 h時(shí)ZLSY5、ZLSY16、ZLSY22這3株菌對(duì)紫莖澤蘭葉片的傷害率達(dá)到97%以上。

圖1 菌懸液對(duì)紫莖澤蘭葉片的侵害程度

3 討論與結(jié)論

昆蟲(chóng)與其共生菌之間有著十分密切的共生關(guān)系,共生菌生長(zhǎng)于昆蟲(chóng)體內(nèi),昆蟲(chóng)為共生菌創(chuàng)造了穩(wěn)定的生活環(huán)境并提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[30-31]。本實(shí)驗(yàn)用形態(tài)鑒定和16S rDNA技術(shù)相結(jié)合的方法第一次分離鑒定了澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)內(nèi)可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌種類,一共分離得到22株菌,編號(hào)為ZLSY10的菌株未被鑒定出來(lái),其余21株菌分屬于3個(gè)門(厚壁菌門、變形桿菌門、放線菌門)、3個(gè)綱、10個(gè)屬。其中變形菌門有10株菌,屬于優(yōu)勢(shì)菌；厚壁菌門有8株菌,為次優(yōu)勢(shì)菌。這與張某等的研究結(jié)果有所不同,他們利用Illumina HiSeq技術(shù)對(duì)澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析時(shí),共注釋了13個(gè)門,其中變形菌門占99%，為優(yōu)勢(shì)菌[20]。出現(xiàn)這種差異的原因可能是所采用的方法不同,應(yīng)用Illumina HiSeq技術(shù)所獲得的是腸道內(nèi)整體的細(xì)菌種數(shù),包括可培養(yǎng)菌和不可培養(yǎng)菌,因此所得的物種數(shù)量較多。在昆蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)的共生菌,其特殊的生長(zhǎng)環(huán)境與昆蟲(chóng)的內(nèi)環(huán)境息息相關(guān),大多數(shù)菌的生長(zhǎng)環(huán)境是體外培養(yǎng)不能提供的;其特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也受昆蟲(chóng)的食性以及食物來(lái)源的影響,因此可培養(yǎng)菌在數(shù)量上就顯得稀少。然而,可培養(yǎng)菌株的獲得在共生菌的研究中是非常有價(jià)值的,通過(guò)形態(tài)或分子鑒定明確其分類地位后,再進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn),可以明確這些菌的功能[32],并可有望從中尋找某些有益細(xì)菌進(jìn)行開(kāi)發(fā)或利用,如找尋可降解或耐受紫莖澤蘭有毒物質(zhì)的菌株。

共生菌在昆蟲(chóng)體內(nèi)可為昆蟲(chóng)生長(zhǎng)提供某些食物中缺乏的重要營(yíng)養(yǎng)成分,補(bǔ)充其食物中的不足,起到調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)平衡、調(diào)節(jié)代謝以及解毒作用[33]。在紫莖澤蘭植株中,若沒(méi)有某些物質(zhì)的作用則植株應(yīng)該均勻生長(zhǎng),不會(huì)出現(xiàn)某部分組織膨大的現(xiàn)象,但在有澤蘭實(shí)蠅取食的部位卻能形成蟲(chóng)癭。蟲(chóng)癭的形成可能是因?yàn)闈商m實(shí)蠅幼蟲(chóng)在取食過(guò)程中產(chǎn)生的物質(zhì)改變了植株的營(yíng)養(yǎng)代謝途徑[34]；據(jù)報(bào)道，在澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)分離到的菌株如不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)的細(xì)菌都具有氮素轉(zhuǎn)化的功能,可以將體內(nèi)固定的氮源轉(zhuǎn)移到體外,供寄主植物生長(zhǎng)利用[35-36]。因此,我們猜測(cè)澤蘭實(shí)蠅體內(nèi)的這兩個(gè)屬的細(xì)菌在蟲(chóng)癭的生長(zhǎng)上也起了主要作用,通過(guò)將氮源物質(zhì)由體內(nèi)轉(zhuǎn)移出,累積于其生活的空間中,從而產(chǎn)生蟲(chóng)癭并快速膨大,這樣蟲(chóng)癭可以增加幼蟲(chóng)的取食面積,并為其提供充足的食物來(lái)源[34]。

在本實(shí)驗(yàn)中,初步發(fā)現(xiàn)有6株菌可以使紫莖澤蘭的葉片失綠甚至腐爛,對(duì)紫莖澤蘭葉片的侵害程度較重。這6株菌分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、泛菌屬(Pantoea)、克呂沃爾菌屬(Kluyvera)。芽孢桿菌屬(Bacillus)在防治植物病原菌方面是被廣泛應(yīng)用的一類生防細(xì)菌,對(duì)多種植物病原真菌有防治作用[37];泛菌屬菌株P(guān)antoeasp. LD1有降解木質(zhì)素以及水稻秸稈的作用[38],在這6株菌中有3株菌是泛菌屬的;抗壞血酸克呂沃爾菌(Kluyveraascorbata)具有硝酸鹽還原能力,能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,植物體能吸收低濃度的亞硝酸鹽,但高濃度的亞硝酸鹽對(duì)植物體有害[39]。在微生物對(duì)紫莖澤蘭葉片致病性的研究中,前人僅研究了鏈格孢菌的作用[29],還沒(méi)有細(xì)菌致病方面的報(bào)道。鑒于以上6株細(xì)菌對(duì)紫莖澤蘭的降解能力,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們將從菌株的安全性入手,篩選出安全的菌株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。剩余的14株菌雖然對(duì)紫莖澤蘭的葉片沒(méi)有致病作用,但在抑菌活性、促進(jìn)澤蘭實(shí)蠅對(duì)紫莖澤蘭的適合度方面是否存在有益作用,還有待于進(jìn)一步的研究。

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