高山，王晶，劉暄，張澤生

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300457）

棕櫚油酸（palmitoleic acid）是一種16碳的單不飽和脂肪酸，雙鍵位于碳端的第7個(gè)碳原子上（16∶1n-7）[1-2]，具有較好的穩(wěn)定性。已有研究表明棕櫚油酸可以緩解多種代謝疾病如肥胖、高血脂、高血糖和炎癥等[2-7]。鑒于其良好的穩(wěn)定性和調(diào)控代謝的功能性，開發(fā)棕櫚油酸產(chǎn)品具有很好的市場前景。

棕櫚油酸主要來源于魚油等海產(chǎn)品。但由于漁業(yè)資源匱乏，棕櫚油酸來源受到限制，難以滿足市場的需求。因此，尋找富含棕櫚油酸的來源并加以利用可以較好的彌補(bǔ)棕櫚油酸產(chǎn)量的不足[2]。Badami等[8]通過研究多種植物的脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果籽油中棕櫚油酸含量較高，約為30%。另外，在昆士蘭果和沙棘得果油中含量也很多，分別為17%和30%左右[9]。還有報(bào)道稱貓兒屎籽（Decaisnea insignis）油中棕櫚油酸的含量可達(dá)55.9%，以及在植物貓爪（Dolichandra unguis）的含量約64%[1]。在這些植物中，沙棘在我國分布最廣，最具開發(fā)潛力。沙棘（HippophaerhamnoidesLinn.）是我國西部地區(qū)最具代表性的經(jīng)濟(jì)作物之一，這種植物具有極好的抗逆性，已經(jīng)被應(yīng)用于防風(fēng)固沙和防治水土流失[10-12]。以沙棘果油為原材料分離棕櫚油酸可以拓展棕櫚油酸的來源，也為沙棘的高值化利用提供參考。

目前關(guān)于棕櫚油酸分離方法的報(bào)道較少，奇拉達(dá)等[13]應(yīng)用CO2超臨界萃取法從沙棘果油中分離棕櫚油酸，產(chǎn)物中棕櫚油酸含量可達(dá)55.24%。張澤生等[14]應(yīng)用分子蒸餾法富集沙棘果油中的棕櫚油酸，其最高純度達(dá)到51.9%。本研究在上述背景下，以沙棘果油為原料，對比分析使用CO2超臨界萃取法、尿素包埋法和分子蒸餾法3種方法對分離效率的影響。在此基礎(chǔ)上，建立了一種高效地從沙棘果油分離棕櫚油酸的方法，即尿素包埋與分子蒸餾復(fù)合法，為沙棘果油深加工利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

沙棘果油由內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原圣果公司提供。實(shí)驗(yàn)使用的氫氧化鉀、95%乙醇、無水硫酸銅、硫酸、鹽酸、乙醚、石油醚、正己烷（均為分析純）：天津化學(xué)試劑一廠。脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；RE3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：亞榮生化儀器廠；SFE CO2超臨界萃取儀：美國Thar科技公司；KDL-1短程分子蒸餾器：德國UIC公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沙棘果油的皂化

稱取20 g沙棘果油，加入2.2 g KOH和40 mL 95%乙醇。在75℃～80℃水浴中回流攪拌2 h～3 h。反應(yīng)結(jié)束后，加適量蒸餾水，旋轉(zhuǎn)蒸餾除去乙醇，加鹽酸酸化至pH 2～3，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置分層。取上層有機(jī)相，用5%NaCl水洗至溶液pH值為中性，得到沙棘果油混合脂肪酸[2]。

1.3.2 沙棘果油脂肪酸的甲酯化

取脂肪酸200 g，置于10 mL具塞管中，加入2 mL 4%硫酸-甲醇溶液。在75℃水浴下反應(yīng)1 h，反應(yīng)完成后，加入2 mL正己烷和適量超純水，靜止待其分層。取上層正己烷相，用無水硫酸鈉干燥，過0.22 μm的有機(jī)膜，置于4℃冰箱中待測[2]。

1.3.3 沙棘果油脂肪酸組成的氣相色譜分析

采用Agilent 7890A氣相色譜分析儀，氫火焰離子檢測器對甲酯化的沙棘果油脂肪酸樣品進(jìn)行檢測。色譜柱：HP-88（100 m×0.25 μm×0.2 μm）；進(jìn)樣口溫度：245℃；檢測器溫度：250℃；流速：1 mL/min；分流比：30 ∶1；進(jìn)樣量：5 μL；升溫程序如下所示：

以峰面積歸一法計(jì)算各脂肪酸組分的相對含量。

以保留時(shí)間定性，峰面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸組分的相對含量。

1.3.4 CO2超臨界萃取法

CO2超臨界萃取法是利用CO2在特定壓力和溫度下形成超臨界流體萃取分離脂肪酸的方法。在超臨界狀態(tài)下，將CO2超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，可以有選擇性的把極性不同的成分萃取分離[15]。本試驗(yàn)采用SFE CO2超臨界萃取儀對沙棘果油混合脂肪酸進(jìn)行分離，分離條件為：萃取釜壓力250 bar、萃取釜溫度37℃、CO2流量 25 mL/min、萃取時(shí)間 1 h。

1.3.5 尿素包埋法

尿素包埋法是一種根據(jù)分子空間體積大小不同分離脂肪酸的方法，其原理是尿素在結(jié)晶過程中會(huì)形成具有一定空間體積的空腔，空間體積小的分子會(huì)被包合于空腔中，沉淀并析出。飽和脂肪酸沒有碳雙鍵，空間體積小易被包合；不飽和脂肪酸因具有雙鍵會(huì)使得碳鏈彎曲，占用更大的空間體積，不易被包合。因此，飽和脂肪酸棕櫚酸等通過尿素包埋被分離，可以提高棕櫚油酸的含量。本操作具體步驟如下：尿素和95%乙醇按比例混合后，在80℃下攪拌回流，待尿素全部溶解后加入脂肪酸，充分混合，于80℃水浴繼續(xù)回流1 h以上使尿素和脂肪酸充分混合，后將此混合溶液置于冷卻循環(huán)器中包合結(jié)晶。包合一定時(shí)間后，迅速抽濾，分離濾液和濾渣。濾液和濾渣部分加入適量蒸餾水后加熱溶解尿素，混合溶液出現(xiàn)分層。分別收集上層有機(jī)相，檢測其中脂肪酸組成[16]。其中，尿素底物比例為 2 ∶1（g/g）、溶劑與尿素比例為 4 ∶1（mL/g）、尿素包埋時(shí)間為12 h。

1.3.6 分子蒸餾法

分子蒸餾法是利用不同物質(zhì)的分子運(yùn)動(dòng)平均自由程的差異來實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)。在超真空條件下，分子量小、熱運(yùn)動(dòng)程度劇烈的組分受熱運(yùn)動(dòng)間距長可以達(dá)到冷凝面進(jìn)行收集，從而實(shí)現(xiàn)混合物的分離。通過氣相分析，發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸的出峰時(shí)間比多不飽和脂肪酸早很多，其分子量和熱運(yùn)動(dòng)程度小，可以通過分子蒸餾進(jìn)行分離，在超真空狀態(tài)下脂肪酸分子受熱發(fā)生熱運(yùn)動(dòng)，根據(jù)熱運(yùn)動(dòng)自由程的距離分離不同脂肪酸組分[17]。本試驗(yàn)采用KDL-1短程分子蒸餾器對沙棘果油混合脂肪酸進(jìn)行分離，分離條件為：100℃蒸餾溫度、0.1 Pa真空度。

1.3.7 尿素包埋-分子蒸餾復(fù)合法

先使用尿素包埋法處理沙棘果油混合脂肪酸，得到尿素包埋產(chǎn)物。應(yīng)用分子蒸餾法對尿素包埋產(chǎn)物進(jìn)行再分離，將兩種方法的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，建立了一種高效的尿素包埋法-分子蒸餾復(fù)合法來分離沙棘果油中的棕櫚油酸。兩個(gè)試驗(yàn)階段分別采用1.3.5和1.3.6所述條件進(jìn)行分離。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016和SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)重復(fù)操作3次，結(jié)果取平均值，以“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”（Mean ±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果油脂肪酸組成分析

采用氣相色譜對沙棘果油原料中的脂肪酸組成進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示，原料中各脂肪酸組成為：肉豆蔻酸0.7%，棕櫚酸32.9%，棕櫚油酸35.5%，十七烷酸0.4%，硬脂酸0.9%，油酸15.3%，亞油酸8.6%，亞麻酸1.4%。

圖1 沙棘果油脂肪酸氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatogram of sea buckthorn fruit oil

2.2 CO2超臨界萃取法、尿素包埋法和分子蒸餾法單獨(dú)使用對分離產(chǎn)物中脂肪酸組成的影響

CO2超臨界萃取法、尿素包埋法和分子蒸餾法分離沙棘果油中棕櫚油酸的脂肪酸組成分析見圖2，通過峰面積計(jì)算，各脂肪酸占總脂肪酸的比例列于表1，分析發(fā)現(xiàn)不同方法處理所得產(chǎn)物的脂肪酸組成有很大差異。

圖2 3種方法所得產(chǎn)物氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of the production of the three extraction method

表1 3種方法分離產(chǎn)物中脂肪酸組成分析（M±SD，n=3）Table 1 The fatty acid composition analysis using three extraction methods（M±SD，n=3） %

CO2超臨界萃取法的分離產(chǎn)物中棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸含量均出現(xiàn)少量下降，而棕櫚油酸含量少量上升，這可能是因?yàn)镃O2超臨界流體極性與棕櫚油酸較接近，使得棕櫚油酸更容易被萃取出來。尿素包埋法的分離產(chǎn)物中棕櫚酸和其他飽和脂肪酸含量大量降低，而油酸、亞油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸含量變化較小，這可能是因?yàn)槟蛩匕袢コ孙柡椭舅崾沟米貦坝退岷肯鄬ι仙?。分子蒸餾法的分離產(chǎn)物中，棕櫚酸含量變化較小，油酸、亞油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸含量下降，這可能是因?yàn)榉肿诱麴s去除了一部分較高分子量的脂肪酸，使得棕櫚油酸含量上升。另外，3種方法對分離得率也有一定影響，CO2超臨界萃取法分離得率為62.6%，尿素包埋法分離得率為56.9%，分子蒸餾法分離得率為46.8%，這可能是因?yàn)榉蛛x成分不同，使得分離得率也出現(xiàn)相應(yīng)變化。

2.3 尿素包埋-分子蒸餾復(fù)合法分離沙棘果油中的棕櫚油酸

通過分析發(fā)現(xiàn)，尿素包埋法主要去除沙棘果油脂肪酸中的飽和脂肪酸部分，而分子蒸餾法主要去除較大分子量的多不飽和脂肪酸部分。結(jié)合這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，本論文提出了使用尿素包埋-分子蒸餾復(fù)合法分離沙棘果油中的棕櫚油酸。如圖3和表2所示，經(jīng)過尿素包埋和分子蒸餾兩步處理后棕櫚油酸的含量達(dá)到73.4%，分離得率為26.3%。此方法可以作為分離沙棘果油棕櫚油酸較為有效的方法。

圖3 尿素包埋-分子蒸餾復(fù)合法所得產(chǎn)物氣相色譜圖Fig.3 The gas chromatogram of the production of the combination of urea complexation and molecular distillation

表2 尿素包埋-分子蒸餾復(fù)合法產(chǎn)物中脂肪酸組成分析（M±SD，n=3）Table 2 The fatty acid composition analysis of the combination of urea complexation and molecular distillation %

2.4 各分離方法得率、純度及分離條件得分析

根據(jù)氣相色譜的分析結(jié)果，在本研究中提出4種沙棘果油中棕櫚油酸的分離方法，包括CO2超臨界萃取法、尿素包埋法、分子蒸餾法和尿素包埋-分子蒸餾復(fù)合法結(jié)果見表3。

表3 3種分離方法的對比分析（M±SD，n=3）Table 3 Comparison of the three extraction method（M±SD，n=3）

對比4種方法的分離性能，結(jié)果如表3所示，盡管采用不同的方法都使得棕櫚油酸的純度得到提高，產(chǎn)生了富集效果。在這4種方法中，使用分子蒸餾法得到的產(chǎn)物分離得率和棕櫚油酸純度都較低；使用CO2超臨界萃取法有最高的分離得率62.6%，但產(chǎn)品棕櫚油酸純度較低；而尿素包埋法可以達(dá)到最好的分離效果，分離得率可以達(dá)到56.9%，其中的棕櫚油酸純度也可以達(dá)到59.3%，使用尿素包埋-分子蒸餾復(fù)合法使得棕櫚油酸含量得到進(jìn)一步提高，但分離得率有所降低。

分析不同方法的分離條件，CO2超臨界萃取法需要耐高壓的設(shè)備和CO2氣體，所需成本較高；分子蒸餾法分離過程中需要較高的真空度，溫度要求不高，不需要萃取劑，對環(huán)境污染較小；尿素包埋法所需條件較溫和，不需要復(fù)雜的設(shè)備，但其產(chǎn)生大量的尿素廢料。尿素包埋-分子蒸餾復(fù)合法使得棕櫚油酸含量得到提高，但分離得率較小，步驟相對繁瑣?？梢愿鶕?jù)所需棕櫚油酸含量和成本選擇相應(yīng)方法，以應(yīng)對不同的生產(chǎn)需求。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究以富含棕櫚油酸的沙棘果油為原料，對比分析使用CO2超臨界萃取法、尿素包埋法、分子蒸餾法和尿素包埋和分子蒸餾復(fù)合法4種方法分離對所得各產(chǎn)物脂肪酸組成的影響。其中尿素包埋法去除了沙棘果油混合脂肪酸中的飽和脂肪酸部分；分子蒸餾法去除了較高分子量的多不飽和脂肪酸部分。綜合這兩種方法的長處，建立了尿素包埋和分子蒸餾復(fù)合法，可以得到棕櫚油酸含量70%的分離物。另外，單使用尿素包埋法不需要特殊設(shè)備，所得分離物棕櫚油酸含量也能接近60%，方便大規(guī)模生產(chǎn)。本論文研究結(jié)果可以為沙棘的高值化利用和棕櫚油酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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