張桂民，賀 花，鄭 立，宋成創(chuàng)，曹修凱，文逸凡，逯倩倩，雷初朝，陳 宏，黃永震*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046）

牛肉是人類重要的蛋白食物來(lái)源。近年來(lái)，隨著國(guó)民生活水平的不斷提高，對(duì)牛肉的消費(fèi)的數(shù)量和質(zhì)量都大大提高。我國(guó)擁有豐富的黃牛品種資源，而秦川牛和郟縣紅牛作為中原牛的典型代表，對(duì)我國(guó)肉牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起著舉足輕重的作用，但與國(guó)外優(yōu)良品種相比還存在前期生長(zhǎng)慢、后軀欠發(fā)達(dá)等不足，因此，進(jìn)一步研究其生長(zhǎng)性狀和遺傳改良就顯得十分必要。

拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation，CNV）是指在基因組上發(fā)生50 bp到幾Mb片段的插入、缺失、復(fù)制等，因其比SNPs（Single Nucleotide Polymorphisms）和Indels覆蓋范圍更廣，遺傳效應(yīng)更大。隨著牛全基因組測(cè)序的完成[1]，大量的拷貝數(shù)變異區(qū)域（Copy number Variation Regions，CNVRs）在牛上被檢測(cè)出來(lái)。Liu等[2]在牛的染色體上檢測(cè)到177個(gè)CNVRs區(qū)域，覆蓋了約占全基因組序列 1.07%的約28.1 Mb 序列。而且很多位于與免疫、泌乳、繁殖等重要性狀相關(guān)的基因上。Hou等[3]在21個(gè)牛品種的539頭個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了682個(gè)CVNs位點(diǎn)，總共覆蓋基因組 139.9 Mb。

GBP2基因是GBP家族中的重要成員，其編碼的蛋白質(zhì)為GTP酶，將GTP水解為GDP，該蛋白質(zhì)可以起到鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)志物的作用。目前揭示的GBPs家族成員的功能主要與細(xì)胞增殖[4]和病原體感染[5]有關(guān)。關(guān)于GBP2基因的功能，在人和小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控以及抗病性上有重要影響[4]，但在牛上的報(bào)道較少。為了研究GBP2基因與牛的生長(zhǎng)性狀的關(guān)系，本研究對(duì)其拷貝數(shù)變異與中國(guó)黃牛的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為進(jìn)一步研究其功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與體尺測(cè)量 本研究所用的110份血樣包括80頭秦川母牛（陜西省秦川牛良種繁育中心，陜西扶風(fēng)）、30頭郟縣紅牛基礎(chǔ)母牛（河南省郟縣）。采集血樣的同時(shí)測(cè)量并記錄體高、體長(zhǎng)、體重、十字部高、胸圍等體尺數(shù)據(jù)，測(cè)定時(shí)記錄年齡。

DNA樣品采集時(shí)用ACD抗凝，冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆?。用Sonstegard等[6]描述的方法提取基因組DNA，分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，用滅菌蒸餾水稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度10 ng/μL，-20℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和RT-PCR擴(kuò)增 以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的牛GBP2基因序列（Gen Bank Accession No. NC_007301.6）為參考序列，利用Primer 5.0（PREMIER Biosoft International，California，USA）設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（表1），檢測(cè)GBP2基因拷貝數(shù)變異，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 引物檢測(cè) 隨機(jī)選取50個(gè)稀釋到10 ng/μL的秦川牛個(gè)體的DNA樣，從中各抽取1 μL混池，用DNA混合池通過(guò)普通PCR檢測(cè)引物。

普通 PCR 反應(yīng)體系：2×Taq PCR Star Mix 5 μL，上、下游引物各5 pmol，DNA模板 10 ng，加ddH2O至10 μL。普通PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min ；95℃變性30 s，60℃退火并延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

將普通PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：取6 μL產(chǎn)物，選用3%的（w/v）的瓊脂糖凝膠，電泳40～50 min，照相分析。

1.2.3 定量檢測(cè) Realtime-PCR反應(yīng)體系：2×TaqTMII 6.25 μL，上、下游引物各 5 pmol，DNA 模板 10 ng，加ddH2O至12.5 μL。Realtime-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火并延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel2010軟件處理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，用SPSS 20.0對(duì)GBP2基因不同拷貝數(shù)類型（Loss，Median，Gain）與體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物檢測(cè)結(jié)果 如圖1所示，用于檢測(cè)GBP2基因拷貝數(shù)的引物特異性較高，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 引物檢測(cè)結(jié)果

2.2GBP2基因不同拷貝數(shù)類型在黃牛中分布差異 如圖2所示，CNV1在2個(gè)品種的拷貝數(shù)分布比較均衡；CNV2在秦川牛中Gain型較多，郟縣紅牛Loss型個(gè)體數(shù)量較少，而且郟縣紅牛個(gè)別個(gè)體拷貝數(shù)很少，品種間差異也不顯著（P＞0.05），表明GBP2基因的拷貝數(shù)變異在2個(gè)不同品種間差異較小，具有一定的相似性（表2）。

2.3GBP2基因的不同拷貝數(shù)與黃牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，通過(guò)Log22-ΔΔCt計(jì)算出不同個(gè)體的拷貝數(shù)，并按照不同的拷貝數(shù)將其分為 3 種類型：拷貝數(shù)增加（Log22-ΔΔCt＞ 0.5，Gain）、拷貝數(shù)減少（Log22-ΔΔCt＜ -0.5，Loss）和拷貝數(shù)不變（-0.5＜ Log22-ΔΔCt＜0.5，Median）。 將 不 同 類 型 個(gè) 體與體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，秦川牛GBP2基因CNV1和CNV2拷貝數(shù)變異與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析如表3和表4所示。在秦川牛中，Loss型在體長(zhǎng)、體重、胸圍等重要生長(zhǎng)性狀顯著優(yōu)于Gain/Median型（P＜0.05）；郟縣紅牛CNV1在腰角寬、坐骨端寬等生長(zhǎng)性狀上也表現(xiàn)為L(zhǎng)oss型個(gè)體顯著優(yōu)于Gain/Median型（P＜0.05）（表5）；郟縣紅牛CNV2拷貝數(shù)變異Loss型體高顯著高于Median型（P＜0.05）（表6）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物信息

圖 2 GBP2基因在2個(gè)牛群中的拷貝數(shù)分布圖

表2 秦川牛和郟縣紅牛不同拷貝數(shù)類型分布的個(gè)體數(shù)量及其比例

3 討 論

近年來(lái)，大量關(guān)于SNPs和Indels的研究發(fā)現(xiàn)，不論是單個(gè)堿基的突變或是小片段的插入缺失都會(huì)對(duì)生長(zhǎng)性狀產(chǎn)生重要影響[8-9]，而拷貝數(shù)變異是比SNPs和Indels更為廣泛的遺傳變異，所以也具有更大的遺傳效應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行研究也十分必要。在畜禽中，CNV的變化也會(huì)是導(dǎo)致一些表型的變化。Fontanesi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ASIP基因的拷貝數(shù)的變異和錯(cuò)義突變導(dǎo)致了羊出現(xiàn)了不同的毛色；Dominic等[11]發(fā)現(xiàn)，雞SOX5基因第1內(nèi)含子拷貝數(shù)的增加導(dǎo)致雞出現(xiàn)豆冠表型。

表3 秦川牛GBP2基因CNV1拷貝數(shù)變異與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

表4 秦川牛GBP2基因CNV2拷貝數(shù)變異與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)因其準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷而被廣泛用于各種實(shí)驗(yàn)，尤其是在分析基因表達(dá)等方面。基因的拷貝數(shù)變異是基因大片段的插入缺失，也就是某一片段發(fā)生數(shù)量上的變化。因此，對(duì)這一片段進(jìn)行定量就能準(zhǔn)確地檢測(cè)出其拷貝數(shù)的變化，對(duì)不同變化的拷貝數(shù)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，找出其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)系，可為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供新的依據(jù)。

表5 郟縣紅牛GBP2基因CNV1拷貝數(shù)變異與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

表6 郟縣紅牛GBP2基因CNV2拷貝數(shù)變異與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

本研究將qPCR技術(shù)用于GBP2基因的拷貝數(shù)變異研究，在拷貝數(shù)變異區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)引物，另外通過(guò)單拷貝的基因進(jìn)行矯正來(lái)檢測(cè)不同牛的拷貝數(shù)變化。GBP2基因的2個(gè)拷貝數(shù)變異CNV1和CNV2在秦川和郟縣紅牛2個(gè)群體中分布較為相似，但秦川牛個(gè)體間拷貝數(shù)差異較大，而郟縣紅牛相對(duì)較小，在2個(gè)品種中，Median類型都較其他類型多，GBP2基因的CNV1和CNV2拷貝數(shù)變異在2個(gè)黃牛品種中表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性，與石濤[12]研究結(jié)果不矛盾。石濤[12]研究發(fā)現(xiàn)，拷貝數(shù)變異在不同牛品種中存在較大的差異，但也有分布相似的品種。

通過(guò)GBP2基因拷貝數(shù)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，不同類型的拷貝數(shù)變異對(duì)黃牛的生長(zhǎng)性狀影響顯著。而GBP2基因?qū)?xì)胞增殖、分化和遷移等有重要影響[4]，另外，GBP2基因還具有抗病原體的作用[5,7]。在牛上對(duì)其進(jìn)行研究，可對(duì)我國(guó)黃牛品種的遺傳改良提供依據(jù)。然而，因?yàn)槲覈?guó)地域遼闊，黃牛品種多樣豐富，且不同地區(qū)的黃牛品種在適應(yīng)性、抗逆性以及生長(zhǎng)性狀等方面都存在有較大差異。本研究只選擇其中2個(gè)品種進(jìn)行研究并不能代表所有品種，尤其是高原地區(qū)以及其他一些雜交改良形成的有突出特點(diǎn)的品種，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步進(jìn)行大量研究。但本研究結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)，GBP2基因CNV1和CNV2 2個(gè)拷貝數(shù)變異區(qū)域不同的拷貝數(shù)類型對(duì)秦川牛和郟縣紅牛生長(zhǎng)性狀影響顯著，可作為其遺傳育種的分子輔助標(biāo)記，為進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行研究打下基礎(chǔ)。

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