鄺良德，任永軍，謝曉紅，雷 岷，李叢艷，鄭 潔，郭志強(qiáng)，張翔宇，張翠霞，楊 超

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066）

激素敏感性脂肪酶（Hormone Sensitive Lipase，HSL）主要負(fù)責(zé)分解脂肪組織中的甘油三酯，并釋放出游離脂肪酸，是調(diào)控脂肪分解代謝的重要因素，同時(shí)，也是影響動(dòng)物機(jī)體脂肪沉積的關(guān)鍵酶之一[1]。HSL的活性受到復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制調(diào)控影響，在機(jī)體不同生理狀態(tài)條件下，動(dòng)物自身會(huì)產(chǎn)生不同激素平衡狀態(tài)，從而影響HSL的活性大小，并且其作用機(jī)理都會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。HSL基因的克隆和研究最早是在大鼠中進(jìn)行的，隨后研究人員檢測(cè)到該基因在人類(lèi)、小鼠和豬中也存在[2-4]。HSL基因主要在脂肪組織、卵巢、心臟、腎上腺、平滑肌和骨骼肌中表達(dá)[5]。正常情況下，HSL在動(dòng)物體內(nèi)存在有活性、無(wú)活性?xún)煞N形式，而且其活性受到磷酸化或者去磷酸化作用調(diào)控。由于HSL基因在染色體上所處的位置和在脂肪代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，許多研究者都認(rèn)為HSL基因是脂肪沉積和代謝相關(guān)性狀的重要候選基因[6-8]。

HSL基因在畜禽脂肪沉積中發(fā)揮著重要作用，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，在豬、牛、羊等畜禽上對(duì)HSL基因多態(tài)性及其對(duì)生產(chǎn)性狀的影響進(jìn)行了大量研究[9-15]。但是，在兔上并沒(méi)有關(guān)于HSL基因多態(tài)性方面的相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究采用PCR-SSCP和直接測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，以齊卡巨型白兔和齊興肉兔為實(shí)驗(yàn)材料，研究HSL基因第1外顯子區(qū)域遺傳多態(tài)性，并探討該基因?qū)@兩個(gè)不同品種肉兔部分生產(chǎn)性狀的影響，為下一步利用分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）進(jìn)行肉兔新品種培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及DNA提取 選取齊卡巨型白兔、齊興肉兔每個(gè)品種35日齡斷乳仔兔各150只組建實(shí)驗(yàn)群體，所有實(shí)驗(yàn)兔在相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下飼喂至84日齡，整個(gè)試驗(yàn)期間自由采食、飲水，于84日齡分別隨機(jī)選取齊卡巨型白兔90只、齊興肉兔98只進(jìn)行屠宰，測(cè)定其部分生產(chǎn)性狀（包括活體重、屠宰率、滴水損失等），同時(shí)采集血液樣品，EDTA抗凝后冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。按照Axygen血液DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作流程提取基因組DNA，經(jīng)檢測(cè)合格后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 引物序列設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中查詢(xún)的兔HSL基因DNA序列（NW_003159415.1）自行設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增HSL基因部分外顯子1區(qū)域，引物序 列：HSL-F：5'- GCAAGAAACATCCACCACA-3'；HSL-R：5'- TGTCCCGACATCCCTTCA-3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為213 bp，引物公司合成。

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中2.5 mmol/L dNTP Mix 2 μL、PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、基因組 DNA 2 μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.125 μL、10 μmol/L 正反向引物各 1 μL、滅菌去離子水 14.875 μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72℃充分延伸10 min，4℃保存。

PCR 反 應(yīng) 結(jié) 束 后， 取 PCR 產(chǎn) 物 4 μL 和 1 μL 6×Loading Bufffer混合后加入含 0.1% Goldview DNA 染料的1.5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，120 V 電壓電泳35 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.2 PCR-SSCP分析 利用該引物擴(kuò)增齊卡巨型白兔和齊興肉兔所有血液樣本DNA，反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同1.2.1，反應(yīng)完成后，取4 μL PCR產(chǎn)物與8 μL變性劑（體積分?jǐn)?shù)95%的去離子甲酰胺10 mL，0.5 mol/L的EDTA（pH8.0）200 μL，溴酚藍(lán)0.025 g和二甲苯青0.025 g）混勻，98℃變性10 min，迅速冰浴10 min，放置5 min。樣品于100 g/L聚丙烯酰胺凝膠（交聯(lián)度Acr ：Bis=9:1）中，在溫度20℃、電壓10 V/cm的條件下電泳7.5 h。電泳結(jié)束后，銀染顯色并照相保存，然后再判定其基因型，并統(tǒng)計(jì)各基因型的個(gè)數(shù)。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物純化測(cè)序與分析 根據(jù)PCR-SSCP分析結(jié)果，選取不同基因型純合子個(gè)體經(jīng)膠回收試劑盒純化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，同時(shí)，利用DNASTAR軟件中的SwqMan程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正和BLAST分析確定SNPs。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率以及進(jìn)行哈代-溫伯格平衡的χ2適合性檢驗(yàn)?；蛐托?yīng)分析采用如下固定模型：Yi=μ+Gi+ei，其中，Yi為個(gè)體生長(zhǎng)性狀觀(guān)測(cè)值，μ為生長(zhǎng)性狀的群體均值，Gi為基因型效應(yīng)，ei為隨機(jī)殘差效應(yīng)。利用SAS 8.0軟件的GLM程序分析基因型均值。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 從實(shí)驗(yàn)兔血液中提取的基因組DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，利用設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果與預(yù)期一致，得到213 bp擴(kuò)增片段，且沒(méi)有非特異擴(kuò)增條帶，可直接用于測(cè)序反應(yīng)和PCR-SSCP分析。

圖1 HSL基因片段PCR擴(kuò)增圖

2.2 SSCP檢測(cè)結(jié)果 利用設(shè)計(jì)合成的HSL基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，共出現(xiàn)3種基因型，分別命名為AA、AB以及BB（圖2）。

圖2 不同基因型的電泳圖

2.3 序列分析結(jié)果 將HSL基因AA型和BB 型2種純合子進(jìn)行雙向測(cè)序（圖3、4），測(cè)序結(jié)果通過(guò)與GenBank中家兔HSL基因DNA序列（NW_003159415.1）進(jìn)行Blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)在家兔HSL基因第1外顯子784 bp處存在A→C的突變。

圖3 AA基因型測(cè)序圖

圖4 BB基因型測(cè)序圖

2.4HSL基因遺傳多態(tài)性分析HSL基因在不同品種家兔群體中的基因型分布，等位基因頻率見(jiàn)表1。在2個(gè)品種家兔群體中均檢測(cè)到3種基因型，2個(gè)品種群體的基因型頻率均為AA＞AB＞BB，AA型為優(yōu)勢(shì)基因型；等位基因頻率均為A＞B，A為優(yōu)勢(shì)等位基因?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，齊卡巨型白兔和齊興肉兔均顯著偏離哈代-溫伯格平衡（P＜0.01）。

2.5HSL基因多態(tài)位點(diǎn)與生產(chǎn)性能關(guān)聯(lián)性分析 對(duì)HSL基因外顯子1多態(tài)位點(diǎn)與生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。由表2可知，在齊卡巨型白兔中，HSL基因AA型和AB型個(gè)體的宰前活體重均顯著高于BB型個(gè)體（P＜0.05）；AA型和BB型個(gè)體的全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率均顯著低于AB型個(gè)體（P＜0.05）。在齊興肉兔中，HSL基因AA型個(gè)體的宰前活體重顯著高于AB型個(gè)體（P＜0.05），極顯著高于BB型個(gè)體（P＜0.01）；BB型個(gè)體的全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率均顯著低于AA型和AB型個(gè)體（P＜0.05），而AA型和AB型個(gè)體間差異不顯著。在2個(gè)品種中，不同基因型個(gè)體的滴水損失和剪切力差異均不顯著（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，HSL基因AA型對(duì)宰前活體重有一定正面影響，而AB型對(duì)全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率有較大影響。

3 討論與結(jié)論

HSL基因作為影響動(dòng)物脂肪沉積和肉質(zhì)性狀的候選基因被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)性狀的相關(guān)研究中。雷明剛等[1]在豬上發(fā)現(xiàn)，HSL基因外顯子1的442 bp處有G→A的堿基變異，把該突變位點(diǎn)多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量、個(gè)體背膘厚、眼肌面積等性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)AG基因型和GG基因型個(gè)體之間在眼肌面積上存在顯著差異。薛慧良等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在豬HSL基因外顯子1的874 bp處存在G→A的轉(zhuǎn)換，該突變位點(diǎn)對(duì)豬背膘厚影響差異顯著。強(qiáng)巴央宗等[17]采用PCR-RFLP和SSCP方法檢測(cè)了藏豬外顯子1和外顯子8的突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)藏豬在這兩個(gè)突變位點(diǎn)的基因型分布均處于脂肪性地方豬和瘦肉型外種豬之間，表現(xiàn)出其品種的特異性。馬志杰等[9]在牦牛HSL基因外顯子1第70位發(fā)現(xiàn)了G→A的堿基突變，該變異導(dǎo)致所編碼的氨基酸由甘氨酸（G）變成了精氨酸（R）。柴志欣等[14]利用PCR-SSCP技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)牦牛HSL基因多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HSL基因外顯子7第6 816處發(fā)生了堿基A→G突變，并且該突變位點(diǎn)對(duì)牦牛的體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、管?chē)?、體重等生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)有顯著影響。劉俊霞等[12]研究發(fā)現(xiàn)，陜北白絨山羊HSL基因外顯子1具有多態(tài)性，相關(guān)分析表明，HSL基因可能是陜北白絨山羊產(chǎn)絨性狀以及胴體性狀的主效基因，或者是與控制這些性狀的主效基因相連鎖在一起。Yang等[18]在綿羊HSL基因內(nèi)含子5、外顯子9分別發(fā)現(xiàn)3、2個(gè)突變位點(diǎn)，采用多變量線(xiàn)性混合效應(yīng)模型分析發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)與眼部肌肉深度（EMD）、眼部肌肉寬度（EMW）和眼部脂肪厚度（FDM）等沒(méi)有相關(guān)性。可見(jiàn)，HSL基因具有豐富的多態(tài)性，且其變異對(duì)家畜的生長(zhǎng)發(fā)育及重要經(jīng)濟(jì)性狀可能具有顯著的遺傳效應(yīng)。

表1 2個(gè)不同品種家兔HSL基因的基因型頻率和等位基因頻率

表2 2個(gè)不同品種家兔HSL基因不同基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

本實(shí)驗(yàn)利用PCR-SSCP結(jié)合測(cè)序的方法分析了齊卡巨型白兔和齊興肉兔HSL基因第1外顯子的遺傳多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家兔HSL基因第1外顯子784 bp處存在A→C的單個(gè)堿基突變，共存在3種基因型，2個(gè)品種兔群體中基因型頻率均為AA＞AB＞BB，AA型為優(yōu)勢(shì)基因型；卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，齊卡巨型白兔和齊興肉兔均極顯著偏離哈代-溫伯格平衡。對(duì)該多態(tài)位點(diǎn)與部分生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，在2個(gè)品種兔中，不同基因型個(gè)體的宰前活體重、全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率差異顯著；不同基因型個(gè)體的滴水損失和剪切力差異均不顯著。HSL基因AA型對(duì)宰前活體重有一定的正面影響，而AB型對(duì)全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率有較大影響。因此，初步推斷該多態(tài)位點(diǎn)可作為一種分子遺傳標(biāo)記用于肉兔育種，但還需要進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)群體數(shù)量進(jìn)行深入研究，以期提供更加豐富的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，更好地用于提高肉兔生產(chǎn)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇育種，為培育肉兔新品種提供一種新思路、新方法。

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