吳 寒 綜述 林浩成 姜 輝 審校

1. 北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科（北京 100191）;2.北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心; 3.北京大學(xué)第三醫(yī)院男科

勃起功能障礙（ED）是老年男性常見(jiàn)的性功能障礙疾病。其發(fā)病與年齡、生活方式及心血管疾病等有關(guān)。目前存在多種治療ED的方式，包括口服5型磷酸二酯酶抑制劑（PDE5Is）、經(jīng)尿道給藥、低強(qiáng)度體外沖擊波、海綿體注射治療、真空負(fù)壓吸引及假體植入等，近年來(lái)干細(xì)胞治療概念在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸成為研究的熱點(diǎn)，尤其在損傷修復(fù)領(lǐng)域，干細(xì)胞治療方興未艾，然而關(guān)于其療效發(fā)揮的具體作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。干細(xì)胞本身具有多向分化潛能，同時(shí)還可能通過(guò)旁分泌機(jī)制發(fā)揮作用。近年來(lái)干細(xì)胞治療的旁分泌作用正越來(lái)越受到學(xué)界關(guān)注，已有大量研究證實(shí)其在干細(xì)胞治療過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。目前認(rèn)為干細(xì)胞旁分泌可能通過(guò)細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）方式實(shí)現(xiàn)，本文將回顧EVs研究相關(guān)進(jìn)展，并探討其應(yīng)用于ED治療的可能性。

一、ED的治療

（一）現(xiàn)有的ED治療手段

過(guò)去的幾十年間，由于對(duì)勃起和ED機(jī)制了解的不斷深入，先后出現(xiàn)多種ED治療手段[1]。雖然目前口服PDE5Is已成為一線治療方式，但是其仍然存在一定局限性，如對(duì)同時(shí)服用硝酸鹽類(lèi)藥物的患者存在誘發(fā)低血壓的風(fēng)險(xiǎn)；部分患者對(duì)藥物本身的副作用難以耐受；此外，高昂的藥品售價(jià)也在一定程度上限制了其應(yīng)用[2]?，F(xiàn)存的其他治療手段，包括經(jīng)尿道給藥、海綿體內(nèi)注射、真空吸引輔助勃起、海綿體假體植入等，均存在特定適應(yīng)證和風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此近年來(lái)學(xué)界對(duì)于探究包括基因治療和干細(xì)胞治療在內(nèi)的新的、可治愈ED的治療方式的熱情與日俱增[4,5]。

（二）ED的干細(xì)胞治療

近年來(lái)，隨著ED逐漸被大眾認(rèn)知并成為世界性的健康問(wèn)題，ED的干細(xì)胞治療吸引了越來(lái)越多的注意。目前已證實(shí)干細(xì)胞對(duì)腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等具有良好的治療效果[6-9]。

陰莖勃起主要依賴(lài)于海綿竇的充血，后者內(nèi)襯單層內(nèi)皮細(xì)胞（ECs），并被多層環(huán)狀和縱行的海綿體平滑肌（CSMCs）包繞。生理狀態(tài)下陰莖勃起的實(shí)現(xiàn)主要依賴(lài)一氧化氮能神經(jīng)參與的一氧化氮/環(huán)一磷酸鳥(niǎo)苷（NO/cGMP）通路實(shí)現(xiàn)。多種病理因素通過(guò)損害上述3種勃起相關(guān)結(jié)構(gòu)造成ED，常見(jiàn)的諸如前列腺癌根治術(shù)后的海綿體神經(jīng)損傷、糖尿病造成的微血管病變和內(nèi)皮損傷等[10]。干細(xì)胞是一類(lèi)具有多向分化潛能的細(xì)胞，能夠向包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、Schwann細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類(lèi)型分化[11]，因此具備針對(duì)器質(zhì)性ED各種損傷進(jìn)行靶向治療的潛在價(jià)值。

已有許多臨床前研究證實(shí)多種干細(xì)胞能夠有效改善ED患者的勃起功能[12]，然而干細(xì)胞移植的安全性問(wèn)題，尤其是移植后腫瘤形成風(fēng)險(xiǎn)也一直為學(xué)界所關(guān)注。首先目前認(rèn)為多種腫瘤的形成起源于干細(xì)胞，因此移植后良性腫物或者侵襲性惡性畸胎瘤形成風(fēng)險(xiǎn)不可忽視。盡管目前已有相當(dāng)數(shù)量的臨床前研究對(duì)干細(xì)胞移植后風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估，然而由于動(dòng)物模型往往很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)移植細(xì)胞在人類(lèi)體內(nèi)的最終結(jié)局；其次在某些臨床應(yīng)用中，往往需要多次大量（通常以數(shù)十億記）使用移植細(xì)胞，在這樣的數(shù)量級(jí)面前，很難保證干細(xì)胞制品中不包含未分化細(xì)胞；最后，同傳統(tǒng)的藥物治療不同，普通藥物在人體內(nèi)存在半衰期且通常清除較快，但干細(xì)胞治療設(shè)計(jì)之初就需要穩(wěn)定數(shù)量的細(xì)胞在人體內(nèi)長(zhǎng)期發(fā)揮作用，而目前無(wú)論在動(dòng)物還是在人體內(nèi)，對(duì)注射后的移植細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)控仍然缺乏有效手段，這樣就更增加了移植干細(xì)胞的不確定性[13]。鑒于此，一類(lèi)由細(xì)胞產(chǎn)生的、由多種生物活性成分構(gòu)成、能夠傳遞細(xì)胞間信號(hào)并具有細(xì)胞間成分交換功能的物質(zhì)——細(xì)胞外囊泡（EVs）進(jìn)入人們的視野。

二、干細(xì)胞細(xì)胞外囊泡（SC-EVs）

（一）EVs的發(fā)現(xiàn)

對(duì)細(xì)胞外囊泡最初的認(rèn)知起始于上世紀(jì)80年代，Trams等的研究發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的成分具有5’-核苷酸酶活性，并把這些成分命名為“微泡”（micro-vesicles）[14]。Johnstone等則將體外培養(yǎng)網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)具有網(wǎng)織紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能特征的小泡命名為外泌體（exosome）[15]。目前認(rèn)為真核及原核細(xì)胞均能產(chǎn)生EVs[2,16-20]，EVs常充當(dāng)細(xì)胞間信號(hào)傳遞和排出代謝廢物的途徑，同時(shí)細(xì)胞間亦通過(guò)EVs彼此交換成分，這一細(xì)胞間信息傳遞方式貫穿細(xì)胞存活全程，與生命活動(dòng)各方面息息相關(guān)[21]。

（二）EVs的成分

EVs是一類(lèi)包含蛋白、核酸和脂質(zhì)等多種成分的具有多種功能的物質(zhì)。人們對(duì)EVs的認(rèn)知有賴(lài)于顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步。細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡成分構(gòu)成復(fù)雜，其構(gòu)成主要由來(lái)源細(xì)胞種類(lèi)及其所處的生理狀態(tài)決定。一般來(lái)說(shuō)EVs膜富含糖鞘脂、膽固醇及磷脂酰絲氨酸[22]。EVs攜帶的蛋白種類(lèi)同來(lái)源細(xì)胞類(lèi)似，但存在一定區(qū)別。某些蛋白在EVs中的出現(xiàn)頻率很高，如HSP70、Alix、某些4次跨膜蛋白（如CD9，CD63，CD81等）以及重要組織相容性抗原II（MHCII）等。EVs攜帶的核酸成分多樣，包括DNA、核糖體RNA、mRNA和非編碼RNA，隨著學(xué)界對(duì)基因編輯的持續(xù)關(guān)注，目前基于EVs核酸成分的研究已成為本領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)[23]。

（三）EVs的分類(lèi)

E V s依據(jù)外形可大致分為三類(lèi)：（1）直徑20～150nm的exosome；（2）直徑稍大（50nm～1μm）的微泡（microvesicles），亦稱(chēng)脫落囊泡（shedding vesicles）[24]；（3）直徑更大（50nm～5μm）的凋亡小體（apoptotic bodies）[25]。三者統(tǒng)稱(chēng)EVs[19]。上述分類(lèi)方法中，三類(lèi)囊泡成分間存在重疊，因此隨著對(duì)EVs了解的不斷深入，開(kāi)始有學(xué)者提出以EVs的來(lái)源區(qū)分其具體類(lèi)型，如exosomes特指來(lái)源于胞內(nèi)的一類(lèi)EVs[26]，而microvesicles則指來(lái)源于細(xì)胞（特別是損傷細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞）胞膜脫落結(jié)構(gòu)[27]。

三、EVs的應(yīng)用

（一）疾病診斷的新方法

現(xiàn)認(rèn)為EVs的成分構(gòu)成具有細(xì)胞特異性，同時(shí)也受來(lái)源細(xì)胞狀態(tài)的影響，個(gè)體在健康與不同疾病狀態(tài)下產(chǎn)生不同成分的EVs進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)及體液中，因此能夠作為評(píng)價(jià)機(jī)體健康或疾病狀態(tài)的指標(biāo)，在疾病早期診斷領(lǐng)域具有重要意義[28]。EVs作為疾病診斷工具的天然優(yōu)勢(shì)有3點(diǎn)，首先是來(lái)源廣泛性，目前認(rèn)為EVs的產(chǎn)生廣泛分布于全身各處的組織細(xì)胞，這是其反映全身多臟器系統(tǒng)生理病理狀態(tài)的基礎(chǔ)[29]；其次是分泌的連續(xù)性，由于EVs的產(chǎn)生是一個(gè)連續(xù)不斷的過(guò)程，這樣就使得EVs具備全天候反映機(jī)體所處的健康或疾病狀態(tài)的能力[30]；最后是可檢測(cè)途徑的多樣性，EVs存在于包括血液、尿液和腦脊液等多種體液成分，這種基于體液中EVs的疾病診斷方法被稱(chēng)為體液活檢，能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)活檢方式，避免了額外的手術(shù)取樣步驟、減少了不必要的損傷[31,32]?，F(xiàn)已證實(shí)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的EVs富含miRNAs，可以作為腫瘤早期診斷的特異marker[33]。除了腫瘤診斷外，EVs在非腫瘤疾病的診斷中也有重要作用，目前已得到證實(shí)的包括肝臟相關(guān)疾病、腎臟疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝綜合征等均可通過(guò)EVs攜帶的疾病相關(guān)因子進(jìn)行早期檢測(cè)[29,34-38]。

（二）潛在的疾病治療作用

過(guò)去數(shù)年間，隨著EVs在多種疾病中的病理生理作用被逐步發(fā)現(xiàn)，其在疾病治療中的可能作用備受關(guān)注，現(xiàn)有資料表明EVs本身攜帶的多種活性分子能夠調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞功能。因此，EVs介導(dǎo)的自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌作用具備作為治療手段的潛力[39]。已有報(bào)道包括間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在內(nèi)的多種干細(xì)胞治療的效果——包括組織保護(hù)、內(nèi)皮生成及損傷修復(fù)等——能夠通過(guò)提取并使用它們產(chǎn)生的EVs成分實(shí)現(xiàn)類(lèi)似的治療作用[40,41]，近期相關(guān)研究也證實(shí)了EVs在基因治療、損傷修復(fù)、抗感染、癌癥治療等領(lǐng)域均有積極作用[39,42]。

以MSCs來(lái)源的EVs為例，目前已被證實(shí)能夠促進(jìn)包括缺氧和高血壓損傷在內(nèi)的多種心血管疾病損傷恢復(fù)[43,44]，其在腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用也得到確認(rèn)[45]；在小鼠乳腺癌模型中，小鼠MSCs來(lái)源的EVs攜帶的miR-16等效應(yīng)分子能夠通過(guò)降低VEGF水平降低腫瘤增殖效率[46]；少突膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的EVs能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘再生[47]。除上述直接作用外，EVs還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)水平發(fā)揮生物效應(yīng)，如選取高表達(dá)IL-4、IL10和TGF-β的樹(shù)突狀細(xì)胞作為來(lái)源，其產(chǎn)生的具有免疫抑制作用的EVs能夠在多種炎癥狀態(tài)中發(fā)揮對(duì)病變組織的保護(hù)作用[48]。

在ED干細(xì)胞治療領(lǐng)域，相當(dāng)數(shù)量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和少量人體試驗(yàn)證實(shí)局部注射MSCs對(duì)包括糖尿病性ED和前列腺癌根治術(shù)后神經(jīng)損傷性ED具有肯定效果[49-52]。近期Albersen等的研究比對(duì)了脂肪干細(xì)胞（ADSCs）及等量細(xì)胞勻漿對(duì)神經(jīng)損傷小鼠的ED治療效果，兩者在改善陰莖勃起功能方面的作用并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明ADSCs細(xì)胞勻漿成分可能具有相應(yīng)的治療作用[53]，在這些勻漿中，EVs可能扮演重要的角色，進(jìn)一步提示SC-EVs具備替代SC發(fā)揮疾病治療作用的潛能。

（三）EVs在ED治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景

1. 理想的靶向治療載體：除了包含細(xì)胞自然產(chǎn)生并包裝的成分，EVs同樣可以作為多種藥物的理想載體，并用于構(gòu)建具有治療效果的效應(yīng)分子-EVs復(fù)合物。EVs的多重特性決定了其潛在的靶向藥物載體潛能：脂質(zhì)包膜結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了其在循環(huán)中的穩(wěn)定性，某些蛋白成分也通過(guò)抑制補(bǔ)體和吞噬作用降低了EVs的清除率[54,55]，這樣就使得EVs適合作為某些低生物利用率藥物的載體[56]。另外，EVs能夠包裝多種物質(zhì)，這樣就使得EVs能夠依據(jù)搭載物質(zhì)的不同發(fā)揮多種作用[57]。此外已證實(shí)局部應(yīng)用EVs能夠顯著增加靶細(xì)胞部位的EVs濃度，這一作用可能與EVs靶向識(shí)別細(xì)胞的能力有關(guān)，這就使得靶向治療存在可能[58]。EVs識(shí)別靶細(xì)胞的機(jī)制仍未完全闡明，目前認(rèn)為EVs對(duì)靶細(xì)胞的定位可能通過(guò)EVs天然攜帶的表面分子與靶細(xì)胞的受體間特異識(shí)別實(shí)現(xiàn)。由于EVs攜帶的表面分子與其來(lái)源細(xì)胞具有同源性，因此當(dāng)EVs來(lái)源細(xì)胞同靶細(xì)胞之間存在特異性識(shí)別關(guān)系時(shí)，EVs就可能通過(guò)特異識(shí)別富集到靶細(xì)胞上，從而實(shí)現(xiàn)靶向定位的效果[59]。

2. 解決海綿體內(nèi)干細(xì)胞（stem cell, SC）注射后高清除率的合理途徑：目前最常見(jiàn)的ED細(xì)胞治療方式為海綿體內(nèi)注射，但由于海綿體本身血供非常豐富，導(dǎo)致局部注射的細(xì)胞在極短時(shí)間內(nèi)被清除并隨血流分布到全身各部[60]，治療效率低下。EVs局部注射后能夠高效作用于靶點(diǎn)部位這一特點(diǎn)解決了以往ED細(xì)胞治療中的薄弱一環(huán)，對(duì)EVs-靶細(xì)胞特異性結(jié)合機(jī)制的進(jìn)一步闡明為構(gòu)建高效的EVs靶向治療體系鞏固了理論基礎(chǔ)。

（四）EVs來(lái)源細(xì)胞的選擇

產(chǎn)生囊泡是細(xì)胞的共性，因此能夠產(chǎn)生EVs的細(xì)胞種類(lèi)繁多，如何選擇恰當(dāng)?shù)膩?lái)源不僅關(guān)系到對(duì)EVs作用機(jī)制的探索，更關(guān)乎其治療效果的最優(yōu)化。一般來(lái)說(shuō)，永生的細(xì)胞系產(chǎn)生EVs的效率較普通原代培養(yǎng)細(xì)胞高，且細(xì)胞的永生化特點(diǎn)使前者更有利于生產(chǎn)大量EVs。然而如前所述，此類(lèi)永生細(xì)胞系產(chǎn)生的EVs存在致癌風(fēng)險(xiǎn)等不確定性。而原代培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的EVs其特性更為明確，是相對(duì)理想的生物治療載體。同時(shí)，使用自體來(lái)源細(xì)胞收集的EVs能夠顯著降低免疫排斥作用。基于以上事實(shí)，EVs是理想的生物治療載體，自體原代培養(yǎng)細(xì)胞的EVs收集及利用是有效且合理的選擇。

對(duì)于ED細(xì)胞治療的理想細(xì)胞來(lái)源，學(xué)界一直在進(jìn)行探索。2004年Bochinski等第一次證明了胚胎干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷性ED的治療作用，研究證實(shí)將胚胎神經(jīng)干細(xì)胞注入海綿體神經(jīng)損傷模型大鼠體內(nèi)3個(gè)月后，相比非治療組，大鼠勃起功能得到恢復(fù)，且一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量顯著上升，提示干細(xì)胞治療有效促進(jìn)了損傷神經(jīng)的恢復(fù)[61]。此后包括胚胎干細(xì)胞（ESCs）、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPSCs）、MSCs、骨骼肌來(lái)源干細(xì)胞（SKMSCs）、脂肪干細(xì)胞（ADSCs）、睪丸基質(zhì)細(xì)胞（HTSCs）和人尿干細(xì)胞（USCs）[4,62-67]在內(nèi)的多種干細(xì)胞均被證明對(duì)治療神經(jīng)損傷性ED有積極的治療作用。其中ADSCs由于相對(duì)容易獲取，不涉及胚胎及人體重要器官的損害，因此一直以來(lái)都是干細(xì)胞治療ED的研究熱點(diǎn)，目前已有許多文獻(xiàn)證實(shí)了其對(duì)神經(jīng)損傷性ED的積極治療效果[4]。

MSCs能夠分化成脂肪、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和包括星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的多種神經(jīng)樣細(xì)胞，是外周神經(jīng)損傷修復(fù)的理想干細(xì)胞類(lèi)型。ADSCs是MSCs的一種，因其提取自成體脂肪組織，因此也被稱(chēng)為脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs），現(xiàn)已明確與傳統(tǒng)的骨髓來(lái)源相比，脂肪組織內(nèi)包含的MSCs密度更大，獲取相對(duì)容易且對(duì)組織損傷更小，因此一直是干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[68]。近年來(lái)已有大量研究證實(shí)ADSCs在不同神經(jīng)退變性疾病動(dòng)物模型具有積極作用[69-71]，且發(fā)揮作用的機(jī)制以旁分泌效應(yīng)為主[72-74]。目前認(rèn)為此類(lèi)旁分泌效應(yīng)的發(fā)揮主要依賴(lài)于ADSCs-EVs實(shí)現(xiàn)[75]。由于目前有充分證據(jù)表明EVs在神經(jīng)保護(hù)和再生過(guò)程中起重要作用[45,47,76,77]，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為EVs能夠?qū)崿F(xiàn)以往干細(xì)胞治療中的神經(jīng)修復(fù)作用，即EVs能夠作為神經(jīng)退變性疾病的非細(xì)胞治療手段[40, 45, 47, 77]。

四、ED治療領(lǐng)域EVs的應(yīng)用前瞻

現(xiàn)已證實(shí)SC-EVs具備修復(fù)包括內(nèi)皮、平滑肌及神經(jīng)等多種組織損傷類(lèi)型的能力，因此具備治療器質(zhì)性ED的潛能[41,78,79]。僅就現(xiàn)有資料來(lái)看，EVs已明確的功能包括傳遞遺傳信息、作為載體搭載藥物及蛋白、靶向定位特定細(xì)胞類(lèi)型并在生物體內(nèi)充當(dāng)穩(wěn)定的藥物治療載體等。以此為基礎(chǔ)，目前SC-EVs在心腦血管疾病防治[43-45,47]、感染性疾病的疫苗研發(fā)[80,81]、腫瘤治療領(lǐng)域[82,83]的研究已取得一定進(jìn)展，其在多種疾病中的治療效果亦得到證實(shí)。有學(xué)者認(rèn)為EVs領(lǐng)域的未來(lái)進(jìn)展可能集中在兩個(gè)方向，即：（1）利用并通過(guò)生物技術(shù)手段增強(qiáng)EVs搭載特定蛋白及RNA的能力、改善EVs對(duì)靶細(xì)胞的定位及后者對(duì)EVs的攝取能力以提升EVs的治療潛能；（2）構(gòu)建具有EVs相似特性的脂質(zhì)體或納米顆粒，開(kāi)發(fā)新一代替代天然EVs的靶向治療制劑。筆者認(rèn)為雖然EVs在多領(lǐng)域研究中的進(jìn)展令人振奮，但其在ED治療領(lǐng)域的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此目前對(duì)EVs能在多大程度上改善ED癥狀、通過(guò)何種機(jī)制或特定成分發(fā)揮ED治療作用以及不同SC來(lái)源的EVs在治療不同類(lèi)型ED中的具體用量等問(wèn)題仍待進(jìn)一步研究。可以預(yù)見(jiàn)的是，對(duì)EVs的深入研究將進(jìn)一步闡明其在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和物質(zhì)交換的具體機(jī)制，從而推動(dòng)EVs研究從具有前景的現(xiàn)象觀察向具備實(shí)際效應(yīng)的成果產(chǎn)出進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

致謝：本文由國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：81601272）；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（資助編號(hào)：7174362）課題基金項(xiàng)目資助

勃起功能障礙; 細(xì)胞外囊泡

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