□ 程水連 益陽市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院

生物傳感器（Biosensors）是由兩種主要組件所構(gòu)成，一種是生物傳感器信號接收或產(chǎn)生部分，例如：生物體分子、組織部份或個體細(xì)胞的分子辨認(rèn)元件，而另一種屬于硬件儀器組件部分，為物理信號轉(zhuǎn)換組件又稱為換 能 器（Transduction element），可將生物訊號轉(zhuǎn)換成可量化之電子訊號，以便進行數(shù)據(jù)分析及輸出處理[1]。生物傳感器定義為使用固定化的生物分 子（immobilized biomolecules）結(jié)合換能器，用來偵測生物體內(nèi)或體外的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)或與之起特異性交戶作用后產(chǎn)生響應(yīng)的一種裝置。如將前述電化學(xué)氧化-還原理論應(yīng)用于生物傳感器上，便稱為電化學(xué)生物傳感器[2]。

1 電化學(xué)生物傳感器結(jié)構(gòu)

電化學(xué)生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)是由三個電極所建構(gòu)的一個基本單元，而這三個電極包括工作電極（Working electrode，WE）、參考電極（Reference electrode，RE）及輔助電極（Counter electrode，CE），如下所述。①工作電極一般采用透明導(dǎo)電玻璃，為欲研究、測試的電極。此電極不固定為陽極或陰極，而是視反應(yīng)的不同而異。若在電極上發(fā)生氧化反應(yīng)，此工作電極為陽極；若發(fā)生還原反應(yīng)，則此工作電極為陰極。②參考電極一般采用銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極，主要是在準(zhǔn)確地設(shè)定工作電極上的電位；所以此電極在測定的電流范圍內(nèi)，本身的電位必須幾乎維持一固定值[3]；因此，一個理想?yún)⒖茧姌O其電化學(xué)性能必須是可逆且穩(wěn)定的，而且必須擁有近似于理想非極化電極（ideal nonpolarized electrode）的特性，例如高交換電流和快速的電位應(yīng)答。③輔助電極是相對應(yīng)于工作電極，所以可能是陰極或陽極。此電極上發(fā)生的電化學(xué)反應(yīng)以不影響工作電極為原則。一般常使用白金絲作為對應(yīng)電極。

每個電化學(xué)生物傳感器都需要一個信號處理裝置，即恒電位儀（Potentiostat），恒電位儀的目的是要用來維持電化學(xué)生物感測器在工作電極與參考電極之間的電化學(xué)電位，進而控制電化學(xué)反應(yīng)平衡，然后將傳感器于工作電極與輔助電極之間的電流輸出，這個電流代表著待測物質(zhì)中的濃度[4]。

2 電化學(xué)方法在咖啡因含量測定中的應(yīng)用

咖啡因在電化學(xué)分析法中最常被利用的方法有線性掃描伏安法（Linear sweep voltammetry ，LSV）、差式脈波伏安法 （Differential Pulse Voltammetry，DPV）、 方 波 伏 安 法（Square wave voltammetry，SWV）以及循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）?？衫眯揎椷^的玻璃碳電極以線性掃描伏安法檢測咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度范圍在 3.0×10-7～1.0×10-4M，回歸系數(shù)為 0.995、偵測極限為 1.0×10-7M，且修飾過的玻璃碳電極對咖啡因有很高的選擇性，并不會受到茶堿、抗壞血酸、葡萄糖、檸檬酸等干擾物質(zhì)的影響。差式脈波伏安法（DPV）在咖啡因的檢測中，咖啡因濃度范圍在 4.0×10-5～6.0×10-4M，其回歸系數(shù)可達(dá) 0.999、偵測極限為 1.2×10-7M。干擾物質(zhì)的研究，將濃度 2.0×10-5M的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加各種外來物質(zhì)（葡萄糖、甘胺酸、組胺酸、檸檬酸、蔗糖、果糖、次黃嘌呤等）進行檢測，結(jié)果顯示咖啡因的檢測結(jié)果并不會受到影響，而樣品的空白添加試驗，其回收率可達(dá)98.6～102 %。差式脈波伏安法具有降低背景訊號的干擾、增加訊號對噪聲的比值（S/N ratio）進而使靈敏度提高的優(yōu)點，且具有非常低的偵測極限[5]。方波伏安法（SWV）在咖啡因的檢測中，咖啡因濃度范圍在 2.0×10-6～1.0×10-3M，其回歸系數(shù)為 0.999 4，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.03×10-7、偵測極限為 3.5×10-7M。循環(huán)伏安法（CV）主要用于探討物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)行為，藉由電位掃描所表現(xiàn)出波峰電位、波峰電流大小以及形狀等，判斷物質(zhì)的電化學(xué)特性且實驗通?？稍诙虝r間內(nèi)完成，是發(fā)展電化學(xué)系統(tǒng)中重要的分析工具。目前，多以循環(huán)伏安法作為探討咖啡因的特性，并未用來檢測咖啡因的含量，因此本研究將以循環(huán)伏安法作為檢測咖啡因含量的研究方法。

2.1 咖啡因在電化學(xué)氧化反應(yīng)中的反應(yīng)機制

咖啡因在電化學(xué)氧化反應(yīng)的過程中可分為兩個步驟，首先咖啡因在氧化過程中，會失去 2e-，并在 C8和 N9端上產(chǎn)生氧化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為1,3,7-Trimethyluric acid，并得到 2H+。

持續(xù)給予電的情況下，1,3,7-Trimethyluric acid 又會再氧化成4,5-dihydroxy-1,3,7-trimethyltetrahydro-1H-purine-2,6,8-trione和4,5-dihydroxy-1,7,9-trimethyltetrahydro-110-H-purine-2,6,8-trione 兩種不穩(wěn)定的化合物?？Х纫蛟陔娀瘜W(xué)氧化反應(yīng)的整體過程為 4e-和 4H+的氧化反應(yīng)?？Х纫蛟陔娀瘜W(xué)氧化反應(yīng)的整體過程中會失去 4e-，可藉此測得其電流的大小，利用不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，可依電流訊號大小做出檢量線。

2.2 奈米金修飾電極

奈米金具有良好的生物兼容性、導(dǎo)電性、催化性能和增加表面體積等特性。近年來，奈米金已被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)上，包括生物測定、生物感測器、化學(xué)傳感器等。其中奈米金修飾電極最常應(yīng)用于免疫傳感器上。免疫傳感器主要是用來偵測抗體與抗原間的相互作用，將抗原或抗體固定在傳感器（sensor）的表面。其檢測分析物的種類范圍很廣，例如醫(yī)學(xué)診斷標(biāo)記（腫瘤標(biāo)記、荷爾蒙等）、藥物（醫(yī)療用或違法藥物）、細(xì)菌、毒素（霍亂毒素、金黃色葡萄球菌等）、環(huán)境污染物（殺蟲劑、除草劑)）等。免疫傳感器的敏感度及特異性決定于抗體抗原的鍵結(jié)親和力與特異性及訊號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的背景雜訊。感測芯片表面的修飾也會影響傳感器的靈敏性、專一性、偵測極限、操作穩(wěn)定性及保存安定性等特質(zhì)。而黃金修飾過的電極能與含硫化物（雙硫鍵化合物、硫化物及硫醇等）有強烈吸附作用，此時含硫化合物會依序排列在金屬表面形成單層，在甲烯基間的凡得瓦力會使該單層方向化及穩(wěn)定化。而奈米金修飾電極可以提高固定化抗體的量，作為很好的修飾材料。

3 總結(jié)

本研究以循環(huán)伏安法檢測咖啡因含量，在掃瞄過程中咖啡因會在高電位下氧化，為了避免網(wǎng)版電極在高電位下受到破壞，則利用奈米金修飾網(wǎng)版電極，藉由改變電極本身的物性來提供偵測時想要的工作電位，以供使用。