林曉 周浩

近視是致盲的主要疾病之一。2016年中國的一個大規(guī)模橫斷面研究[1]顯示，近視在18歲學(xué)齡兒童中的發(fā)病率達(dá)到了80%，而在40歲及以上的成年人中達(dá)到了17%。近視發(fā)病率逐年增加，在2020年全世界將有1/3的人口罹患近視[2]。

目前尚無有效控制近視進(jìn)展的方法，臨床上應(yīng)用的后鞏膜加固術(shù)因長期效果不明確以及存在的并發(fā)癥等原因尚存爭議[3-4]。鞏膜膠原交聯(lián)法可以改變膠原的變性溫度、機械強度和抗蛋白降解能力從而增強鞏膜的力學(xué)強度，成為防治近視進(jìn)展的新方法。近年來研究[5-8]表明，使用核黃素作為光敏劑輔以紫外光或藍(lán)光照射的光化學(xué)交聯(lián)法以及Tenon囊下注射甘油醛、京尼平及羥甲基甘氨酸鈉等試劑的化學(xué)試劑交聯(lián)法均可增強鞏膜組織的硬度。

1 鞏膜在近視發(fā)展中的變化

鞏膜是決定眼球尺寸和屈光狀態(tài)的關(guān)鍵[9-10]。鞏膜由鞏膜細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)組成，鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)包含不同直徑的膠原纖維、彈性纖維及纖維間質(zhì)。鞏膜細(xì)胞合成、降解細(xì)胞外基質(zhì)成分[9-11]。鞏膜的生物力學(xué)特征由膠原纖維的直徑、分布和方向所決定[12]。在近視的發(fā)展過程中，肌成纖維細(xì)胞減少和收縮力下降，鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑，膠原減少，膠原分子內(nèi)、分子間結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定和破壞，最終導(dǎo)致鞏膜生物力學(xué)改變，如應(yīng)力、應(yīng)變參數(shù)值和彈性模量較正常眼低[9-10, 13-15]。綜上所述，任何旨在緩解高度近視相伴隨的視覺惡化的長期療法，都應(yīng)當(dāng)以防治鞏膜重塑為目標(biāo)[9, 16]。

2 膠原交聯(lián)術(shù)的原理

隨著年齡增長,人的角膜膠原會發(fā)生酶或非酶介導(dǎo)的交聯(lián)反應(yīng)：酶參與調(diào)節(jié)的反應(yīng)由賴氨酸氧化酶主導(dǎo)催化羥賴氨酸、賴氨酸與它們各自的醛基產(chǎn)生氧化反應(yīng)，而后這些被氧化的醛基又與其他醛基產(chǎn)生分子內(nèi)與分子間的交聯(lián)[17]；非酶介導(dǎo)的反應(yīng)則是通過膠原與葡萄糖及其氧化產(chǎn)物等的反應(yīng)，降低膠原被降解位點的可及性從而減少膠原的降解，主要由糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)、化學(xué)交聯(lián)劑(如戊二醛、無環(huán)β硝基醇、京尼平等)、光化學(xué)反應(yīng)(如核黃素輔助的紫外光、藍(lán)光的電離輻射作用)介導(dǎo)[18-19]。膠原交聯(lián)術(shù)通過這些反應(yīng)誘導(dǎo)膠原纖維之間形成共價鍵(交聯(lián))，提高膠原交聯(lián)的密度，增加膠原纖維的直徑，降低膠原被降解位點的可及性從而提高組織對蛋白水解酶的耐受性[20-22]。這一原理已被用于圓錐角膜的臨床治療中，近年來又被用于鞏膜膠原交聯(lián)的研究中[5-6, 22-27]。有研究[28]認(rèn)為，4 nm以下的小纖維橫向融合而使膠原直徑增大，膠原直徑與低負(fù)荷下的彈性模量呈正相關(guān)。膠原交聯(lián)術(shù)可以通過提高鞏膜膠原纖維之間共價鍵的密度、增加膠原纖維直徑以及增強其對蛋白水解酶的耐受性，就近視眼鞏膜膠原減少、膠原分子內(nèi)或分子間結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定和破壞的特點有針對性地進(jìn)行治療，改變鞏膜的生物力學(xué)特征。

3 鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)

鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)主要分為光化學(xué)交聯(lián)法和化學(xué)試劑交聯(lián)法。光化學(xué)膠原交聯(lián)法使用核黃素輔助下的紫外光照射或藍(lán)光照射，作用的部位主要包括在近視早期就開始出現(xiàn)力量減弱的鞏膜赤道部，以及變化相對較晚較劇烈的鞏膜后極部[9]。在Kwok等[29]的研究以前，光化學(xué)鞏膜膠原交聯(lián)法需要費時地進(jìn)行眼球周圍軟組織解剖以暴露光照鞏膜區(qū)域?；瘜W(xué)試劑交聯(lián)法則是在眼球的Tenon囊下注射化學(xué)試劑進(jìn)行交聯(lián)，這些化學(xué)試劑包括甘油醛[20]、京尼平[16]及羥甲基甘氨酸鈉[8]等?；瘜W(xué)試劑交聯(lián)法不需手術(shù)暴露治療區(qū)域，通過Tenon囊下注射的方式能夠使液體在Tenon囊下沿球周擴散到達(dá)后極和赤道部鞏膜[30]。

3.1 核黃素-紫外光交聯(lián)鞏膜膠原 核黃素-紫外光交聯(lián)鞏膜膠原的原理為非酶介導(dǎo)的光化學(xué)反應(yīng)。光化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)只在核黃素被紫外光激發(fā)的地方發(fā)生：光敏劑核黃素吸收370 nm 或430 nm波長的紫外光的能量被激發(fā)到三線態(tài)，產(chǎn)生單線態(tài)氧為主的活性氧族[21]。在氧氣充足時，活性氧族可以持續(xù)與膠原纖維的羰基團(tuán)發(fā)生Ⅱ型反應(yīng)；在氧氣被紫外光耗盡時，則發(fā)生Ⅰ型反應(yīng)[31]。光化學(xué)反應(yīng)介導(dǎo)膠原的氨基酸分子內(nèi)或分子間產(chǎn)生共價連接(交聯(lián))，從而提高膠原纖維的機械強度和抗蛋白酶消化的能力。核黃素在反應(yīng)中可以起到減少其對組織的穿透性損傷的保護(hù)作用。

Wollensak等[23]先用0.1%核黃素浸潤兔眼球赤道部到后極部的鞏膜5 min，并在術(shù)前5 min開始每隔5 min 用核黃素溶液浸潤眼球，用能量4.2 mW/cm2、波長370 nm的紫外光照射兔眼的鞏膜30 min，通過對其應(yīng)力-應(yīng)變的分析發(fā)現(xiàn)交聯(lián)處理1 d后雖然極限應(yīng)力較對照組可增加227.9%，極限應(yīng)變減少54.52%，卻存在視網(wǎng)膜損傷。2009年，Wollensak等[24]用波長370 nm、能量為3 mW/cm2的紫外光在0.1%核黃素溶液作為光敏劑預(yù)先處理過的兔眼赤道部鞏膜照射30 min，發(fā)現(xiàn)實驗眼兔鞏膜的楊氏模量在8個月時較對側(cè)眼高502%，同時極限應(yīng)力較對側(cè)眼鞏膜高213.8%，此時沒有組織損傷。Wang等[25]在實驗開始時及實驗期間每分鐘用核黃素溶液浸潤兔眼球，用365 nm 波長、3 mW/cm2能量的紫外光作用于兔的右眼赤道部鞏膜，以相同的核黃素處理兔的左眼赤道部鞏膜作為對照組，用視網(wǎng)膜TUNEL染色法檢測標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)組兔的視網(wǎng)膜上較非交聯(lián)組有更多的凋亡細(xì)胞，電鏡下出現(xiàn)視網(wǎng)膜光感受器層細(xì)胞線粒體的腫脹和線粒體嵴消失，術(shù)后1周、1個月、3個月后患眼較對側(cè)眼的暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖波幅顯著減少。他們據(jù)此認(rèn)為，此方案從術(shù)后兔視覺功能重建的角度來說并不足夠安全。照射總能量、照射方案都是影響光化學(xué)膠原交聯(lián)法造成組織不同損傷程度的因素。高能量強度的紫外光聯(lián)合短時間照射與低能量強度聯(lián)合長時間照射，結(jié)果可能不同。Dotan等[32]在照射前20 s及照射期間每20 s應(yīng)用0.1%的核黃素溶液浸潤照射區(qū)域，并用57 mW/cm2能量、370 nm波長的紫外光在形覺剝奪法誘導(dǎo)近視的兔眼的赤道部鞏膜照射較短的時間(200 s)，在術(shù)后55 d對比發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組的眼軸增長數(shù)值具有顯著差異，證明此方案達(dá)到了減緩眼軸延長的效果；同時，所有交聯(lián)組的兔鞏膜組織學(xué)檢查均沒有發(fā)現(xiàn)壞死、炎癥、萎縮等反應(yīng)。Liu等[5]發(fā)現(xiàn)，以0.1%核黃素溶液為光敏劑在離焦性近視的豚鼠模型的鞏膜赤道部及后極部應(yīng)用370 nm波長、57 mW/cm2能量的紫外光作用300s后的交聯(lián)組，較對照組有較高的鞏膜的強度，且眼軸的延長更少；術(shù)后6周在光鏡下沒有發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜等鄰近組織的損傷。

3.2 核黃素-藍(lán)光交聯(lián)鞏膜膠原 核黃素-藍(lán)光的交聯(lián)原理與核黃素-紫外光相似。應(yīng)用光照法時，光的波長越大穿透性越大，并且造成生物損傷的可能越小。波長450 nm左右的藍(lán)光比波長365 nm左右的紫外光有著更大的穿透深度，可能對鞏膜和視網(wǎng)膜組織損傷更小[26-27, 33-34]。

Iseli等[33]在2008年首次介紹了核黃素聯(lián)合藍(lán)光照射交聯(lián)法。他們用0.5%核黃素溶液作為光敏劑，26 mW/cm2能量、465 nm波長的藍(lán)光照射成年兔赤道部鞏膜20 min，在4周后由應(yīng)力-應(yīng)變曲線證明了藍(lán)光可以使兔鞏膜變硬，在光鏡下無視網(wǎng)膜損傷。Iseli[26]等以金吉拉和新西蘭幼兔為實驗對象，用5%核黃素溶液作為光敏劑聯(lián)合藍(lán)光照射兔鞏膜，并將藍(lán)光的能量梯度設(shè)定為7組(15、40、80、150、200、400、650 mW/cm2)，發(fā)現(xiàn)400 mW/cm2及以上能量的藍(lán)光在2種兔中，都會引起視網(wǎng)膜細(xì)胞變性及大量膠原組織結(jié)構(gòu)改變的病理性改變，這些改變局限于治療區(qū)域。15 mW/cm2能量的藍(lán)光照射可以顯著減慢兔眼球生長，并且可以維持穩(wěn)定24周[6, 26]。Schuldt等[35]用450 nm波長、能量在12～100 mW/cm2內(nèi)的不同能量梯度的藍(lán)光分別照射離體鞏膜條帶，分析其彈性模量 (elastic modulus, G′)、粘滯力模量(viscous modulus, G〞)等力學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)核黃素-藍(lán)光照射可以提高鞏膜的G′和G〞，并且相對彈性模量(relative elastic modulus， ΔG′，照射組/對照組)的值在12 mW/cm2及25 mW/cm2為1.5，50 mW/cm2或100 mW/cm2的照射方案下ΔG′為1.8，而在200 mW/cm2時ΔG′降低為1。在藍(lán)光的強度在100 mW/cm2內(nèi)時鞏膜的硬度隨著藍(lán)光的強度升高而升高，在沒有光敏劑核黃素溶液的情況下單獨應(yīng)用核黃素或藍(lán)光(能量均為25 mW/cm2)均不能改變鞏膜組織的彈性模量。2017年，Kwok等[29]用聚二甲硅氧烷彈性體制成厚度在1.5 mm內(nèi)的錐形光波導(dǎo)管，由此易于彎曲的導(dǎo)管導(dǎo)入波長445 nm、能量分別為25 mW/cm2和50 mW/cm2的藍(lán)光，對新鮮豬眼赤道部的鞏膜環(huán)繞交聯(lián)30 min。此研究發(fā)現(xiàn)與8%應(yīng)變對應(yīng)的楊氏模量分別為(10.9±1.2)Mpa及(10.7±1.0)Mpa，均分別與相應(yīng)光照能量強度下用直接核黃素聯(lián)合光照法照射過的對照組豬鞏膜的楊氏模量沒有差異。這種光照法突破了此前物理交聯(lián)法照射范圍較小(10～100 mm2)的局限之處，可以實現(xiàn)單次長于7 cm的光照范圍，并提高了光照的均勻一致性[29]。

3.3 Tenon囊下注射化學(xué)試劑交聯(lián)鞏膜膠原 目前應(yīng)用于鞏膜膠原交聯(lián)的化學(xué)交聯(lián)法的試劑有甘油醛[7, 36]、戊二醛[37]、無環(huán)β硝基醇[38]、京尼平[16]和甲醛釋放劑(formaldehyde-releasing agents, FARs)[39]等。甘油醛為糖代謝的中間產(chǎn)物，無毒，而且有很高的交聯(lián)特性[39]。賴氨酸氧化酶作用于膠原大分子產(chǎn)生的分子間反應(yīng)是醛類衍生物交聯(lián)組織的本質(zhì)；除此以外，甘油醛還有著非酶糖基化的通路。非酶糖基化是糖醛化合物的醛基與蛋白質(zhì)分子如賴氨酸之間發(fā)生非酶化學(xué)反應(yīng)(Maillard反應(yīng))，生成AGEs，使組織堅固且增加了對降解組織酶的抗性[40-41]。

2008年，Wollensak等[20]在14 d內(nèi)于Tenon囊下注射0.15 mL濃度為0.5 mol/L的甘油醛溶液5次，發(fā)現(xiàn)試驗結(jié)束時被交聯(lián)的兔鞏膜較對照組的楊氏模量和極限應(yīng)力都得到了顯著提高，兔角膜緣及眼外肌處出現(xiàn)輕微的炎性浸潤及少量角膜細(xì)胞，視網(wǎng)膜不受影響。同年，Wollensak等[36]研究這種交聯(lián)方法對鞏膜生物力學(xué)性質(zhì)的長期效果，發(fā)現(xiàn)術(shù)后第4個月、8個月鞏膜的楊氏模量分別增加989.6%、554.17%，極限應(yīng)力分別增加325%、254.17%，極限應(yīng)變減少58.84%、37.24%。此鞏膜膠原交聯(lián)方法可長期(至少8個月)有效增強鞏膜的生物力學(xué)性質(zhì)且未出現(xiàn)組織損傷[36]。Chu等[7]發(fā)現(xiàn)，在形覺剝奪誘導(dǎo)近視4周的豚鼠于Tenon囊下每周注射2次0.5 mol/L濃度的甘油醛，實驗結(jié)束時鞏膜條帶的楊氏模量和應(yīng)力增加，但眼軸卻沒有得到控制。他們分析其原因為豚鼠在短期的近視模型期間不會出現(xiàn)鞏膜膠原變細(xì)，在此研究中被提高的鞏膜硬度不足以在形覺剝奪的豚鼠模型減緩其近視的進(jìn)展。此外，有研究[42]報道，由于甘油醛誘導(dǎo)形成AGEs，使鞏膜特別是篩板處變硬，彈性下降，可增加青光眼模型小鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷易感性。戊二醛有一定的毒性，可引起支氣管炎及肺水腫，其安全性有待考量[37]。無環(huán)β硝基醇在生理情況下可以作為甲醛和亞硝酸鹽釋放劑從而交聯(lián)膠原組織。鞏膜條帶熱收縮實驗表明，硝基較多的高級硝基醇化合物(higher order nitroalcohols, HONAs)比單個的硝基醇化合物有著更高的交聯(lián)效能[38]，但該方法尚未進(jìn)行體內(nèi)實驗，遠(yuǎn)期療效以及毒副作用尚不明確。京尼平是一種從梔子花中提取的天然交聯(lián)劑，其細(xì)胞毒性低于戊二醛和環(huán)氧化合物。在單眼形覺剝奪21 d的豚鼠Tenon囊下注射0.1 mL濃度為0.5%的京尼平可以提高其鞏膜的硬度并減緩眼軸延長[16]，但這種交聯(lián)劑的長期安全性和有效性仍待探討。FARs是最新的交聯(lián)劑,它作為防腐劑存在于流行的化妝和個人護(hù)理用品中[39]。Babra等[39]從5個FARs中篩選低毒的組織交聯(lián)試劑，以2種HONAs作為對照，發(fā)現(xiàn)在一定條件下雙咪唑烷基脲和羥甲基甘氨酸鈉與BNAs相比，效能更高而細(xì)胞毒性相似。Planar 細(xì)胞培養(yǎng)實驗顯示，F(xiàn)ARs對細(xì)胞的毒性高于甘油醛而低于戊二醛[39]。2017年，Zyablitskaya等[8]以離體的兔頭為實驗對象，用40 mmol/L及400 mmol/L濃度的羥甲基甘氨酸鈉在Tenon囊下注射400 μL后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，并用鞏膜條帶的熱變性實驗來分析交聯(lián)效果，發(fā)現(xiàn)在注射位點及周圍的鞏膜膠原顯示出更高的信號，被交聯(lián)的鞏膜有更大的膠原束。目前，還沒有研究在動物模型驗證FARs交聯(lián)鞏膜的有效性和安全性。

4 結(jié)語

綜上所述，膠原交聯(lián)術(shù)可以通過誘導(dǎo)性的膠原交聯(lián)改變鞏膜的生物力學(xué)特征，通過增強鞏膜的抗擴張力從而控制近視進(jìn)展。然而，不同物種之間鞏膜結(jié)構(gòu)具有明顯差別，交聯(lián)參數(shù)如波長、照射時長、照射部位的變化也將導(dǎo)致交聯(lián)效果不同。所以，只有對近視動物模型乃至于人進(jìn)行鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)的研究，才可以將此類技術(shù)應(yīng)用至臨床。此外，膠原交聯(lián)術(shù)在應(yīng)用于臨床前還需要通過動物實驗解決如下問題：①目前研究多是對鞏膜條帶進(jìn)行分析，缺乏再現(xiàn)活體眼內(nèi)的鞏膜力學(xué)特征的方法，模擬活體的鞏膜狀態(tài)的力學(xué)測定方法仍需進(jìn)一步探索；②通過膠原交聯(lián)法交聯(lián)過的鞏膜是否能在整個眼球發(fā)育期間抵抗近視的眼球擴張；③如何避免不同光化學(xué)交聯(lián)方案及化學(xué)交聯(lián)劑對視網(wǎng)膜的潛在毒性作用，如何避免交聯(lián)引起的副作用，如甘油醛交聯(lián)法增加青光眼模型CD1小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷易感性[42]。