劉寧華 張?zhí)煊?/p>

先天性小耳畸形的治療是整形外科修復(fù)重建領(lǐng)域中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。其發(fā)病原因可能與妊娠期暴露于藥物、酗酒、遺傳等因素有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球平均發(fā)病率約為2.06/10 000[1]，我國(guó)的小耳畸形發(fā)病率約為3.06/10 000[2]。目前先天性小耳畸形的修復(fù)重建方法主要為自體肋軟骨移植和人工支架植入。然而，自體肋軟骨移植對(duì)醫(yī)師的雕刻技藝要求較高，且可能造成胸廓畸形；而人工支架植入有可能導(dǎo)致感染、移植物排斥和外露等風(fēng)險(xiǎn)。耳郭軟骨組織工程將具有成軟骨能力的種子細(xì)胞和支架材料復(fù)合，構(gòu)建具有組織形態(tài)與功能的人耳形狀組織工程軟骨，為先天性小耳畸形的治療提供了新的方案。本文就目前耳郭軟骨組織工程的種子細(xì)胞、支架材料、新技術(shù)與展望3個(gè)方面進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

1 種子細(xì)胞

耳郭軟骨組織工程要求種子細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)具備與生理狀態(tài)耳郭軟骨相似的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能。理想的種子細(xì)胞應(yīng)該具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：①取材容易，細(xì)胞量大，可盡量減少對(duì)患者的二次損傷；②增殖能力強(qiáng)大，同時(shí)具備成軟骨能力；③與支架材料具有很好的組織相容性，黏附能力強(qiáng)；④生物安全性好，無明顯的免疫排斥，無毒副作用和致瘤性。目前最常用的種子細(xì)胞包括自體軟骨細(xì)胞、異種或異體軟骨細(xì)胞、具有成軟骨能力的間充質(zhì)干細(xì)胞等。

1.1 軟骨細(xì)胞 自體軟骨細(xì)胞無免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)，可來源于患者其他部位的軟骨或殘耳軟骨。前者取材時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者創(chuàng)傷和痛苦；而殘耳軟骨屬于彈性軟骨，取材簡(jiǎn)便，同時(shí)具備和正常軟骨相似的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)功能[3]，且對(duì)供區(qū)的形態(tài)和功能無影響。然而，殘耳軟骨組織量小，為構(gòu)建正常耳郭大小的軟骨組織，需要進(jìn)行體外擴(kuò)增以獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量；而在體外培養(yǎng)傳代可能會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象, 使其逐漸喪失成軟骨能力。康寧等[4]分離培養(yǎng)人殘耳軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞傳至第4 代時(shí)仍保留較好的成軟骨能力，但傳至第7、8代時(shí)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)表型去分化，表明軟骨細(xì)胞已喪失了成軟骨能力。有研究[5-6]發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞的去分化過程可以通過與生長(zhǎng)因子的共培養(yǎng)而減緩。Shasti 等[5]發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，而骨形成蛋白7可增加彈性纖維、Ⅱ 型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)，從而減弱軟骨細(xì)胞的去分化現(xiàn)象。Ting等[6]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可顯著增加軟骨細(xì)胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)，協(xié)助維持軟骨細(xì)胞的表型。2009年，Yanaga等[7]將4例患者的殘耳軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，將2～3代的軟骨細(xì)胞注射至患者下腹部皮下；6個(gè)月后取出軟骨組織，經(jīng)手工雕刻進(jìn)行耳郭重建。隨訪2～5年后患者軟骨無明顯吸收。同種異體軟骨細(xì)胞免疫排斥作用小，但是可能存在傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)供體的損傷較大。異種軟骨細(xì)胞因免疫排斥嚴(yán)重，臨床上較少應(yīng)用。

1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的成軟骨能力，是軟骨組織工程中的研究熱點(diǎn)。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是研究最早、應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞，但是它來源于骨髓，取材相對(duì)困難，數(shù)量有限，術(shù)后不良反應(yīng)較多。而脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具有自我更新和多分化潛能，且具有取材方便、來源充足、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。目前間充質(zhì)干細(xì)胞主要通過以下途徑誘導(dǎo)分化：①通過添加由細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分、非蛋白類物質(zhì)組成的成軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)干細(xì)胞向成軟骨分化；②通過基因重組技術(shù)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)干細(xì)胞向成軟骨分化[8]；③通過與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬軟骨微環(huán)境，誘導(dǎo)干細(xì)胞向成軟骨分化[9]。然而，外源性蛋白和基因轉(zhuǎn)染可能會(huì)導(dǎo)致病原體污染或致瘤性，且誘導(dǎo)過程中可能引起軟骨肥大的相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)，如基質(zhì)金屬蛋白酶13、Ⅹ型膠原、堿性磷酸酶等，導(dǎo)致軟骨出現(xiàn)血管化或骨化[10]。因此，現(xiàn)在越來越多的研究致力于組織微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞的定向分化作用，其作用機(jī)制可能與軟骨細(xì)胞自身分泌的生長(zhǎng)因子有關(guān)[11]。其中，軟骨細(xì)胞分泌的骨形成蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素樣生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子可促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的定向分化。Cai等[12]發(fā)現(xiàn)，將殘耳軟骨細(xì)胞與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)并植入裸鼠體內(nèi)，可以顯著增加脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)成軟骨能力。而軟骨細(xì)胞分泌的甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白[11]可抑制脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在成軟骨分化過程中成骨分化的能力。

2 支架材料

理想的耳郭軟骨組織工程的支架材料應(yīng)具有以下特點(diǎn)：①生物相容性好，不易引起炎癥和毒性反應(yīng)；②機(jī)械強(qiáng)度和可塑性好，并有一定的抗磨損特性(因?yàn)槎螤钚枰L(zhǎng)期保持，需要對(duì)抗皮膚張力維持自身特定形態(tài))；③生物可降解性及降解可調(diào)節(jié)性；④良好的表面活性和適宜的孔徑大小，有利于種子細(xì)胞黏附和增殖；⑤無免疫原性。根據(jù)來源，耳郭軟骨組織工程支架材料可分為以下3類。

2.1 天然生物材料 天然生物材料取材于自然界，具有生物相容性好、毒性小、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也具有機(jī)械強(qiáng)度較差、產(chǎn)品不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。常見的耳郭軟骨組織工程材料包括藻酸鹽[13]、殼聚糖[14]、膠原[15]等。藻酸鹽是比較常用的天然軟骨組織工程支架材料，其特有的多孔結(jié)構(gòu)有利于軟骨細(xì)胞增殖及維持其球形細(xì)胞形態(tài)。但是藻酸鹽的機(jī)械性能較差且極易降解，故限制了其臨床應(yīng)用。殼聚糖是甲殼質(zhì)經(jīng)過濃堿處理以后脫去乙酰基的產(chǎn)物，無味、無毒性，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)成分糖胺聚糖相似，因此它們和相應(yīng)的降解產(chǎn)物低聚糖都具有良好的生物相容性；但單純應(yīng)用殼聚糖制成的海綿狀支架材料易破碎，其機(jī)械強(qiáng)度及韌性達(dá)不到耳郭軟骨組織工程材料的需求。膠原是一種天然蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物的皮膚、骨、軟骨和韌帶等組織中，具有支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能。膠原也是細(xì)胞外基質(zhì)中的重要組成部分，一般是白色透明、無分支的原纖維，周圍基質(zhì)由黏多糖和其他蛋白質(zhì)構(gòu)成。Deponti等[15]將耳軟骨細(xì)胞與Ⅰ型膠原支架進(jìn)行體外共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞能在膠原支架上增殖，并且軟骨細(xì)胞表型在共培養(yǎng)3周之內(nèi)無明顯變化。此外，脫細(xì)胞外支架材料在再造方面也有較多的研究。Utomo等[16]提出軟骨來源的脫細(xì)胞外基質(zhì)支架可保持原有膠原和彈性纖維的含量，其組織結(jié)構(gòu)和形狀也沒有明顯改變，并擁有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可作為耳郭軟骨組織工程支架材料。隨后Tang 等[17]的研究證明，在無需外源性生長(zhǎng)因子的情況下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨來源的脫細(xì)胞外基質(zhì)支架共培養(yǎng)3周，可向軟骨細(xì)胞分化并形成類似軟骨樣組織，證明脫細(xì)胞外基質(zhì)支架具備誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的能力。此外，為了提高耳郭軟骨組織工程支架材料的抗磨性，Lin等[18]將成骨誘導(dǎo)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與小腸黏膜下層支架植入裸鼠背部，發(fā)現(xiàn)該支架能在1年內(nèi)維持較好的耳解剖結(jié)構(gòu)，并且具有類似正常軟骨的力學(xué)性能。

無創(chuàng)數(shù)字?jǐn)z影測(cè)量與計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)/計(jì)算機(jī)輔助制造(computer-assisted design/computer-assisted manufacturing ，CAD/CAM)技術(shù)的逐漸成熟為生物支架材料3D 打印技術(shù)提供了很好的技術(shù)支持，可體外打印出模擬耳郭復(fù)雜曲面幾何形狀和微型纖維結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原支架[19]，支架與耳郭軟骨細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)包埋6個(gè)月仍能展現(xiàn)出良好的對(duì)耳輪、耳輪、耳垂等耳郭標(biāo)志性結(jié)構(gòu)[20]。

2.2 人工合成材料 人工合成材料是人為地把各種有機(jī)高分子材料經(jīng)化學(xué)聚合、靜電紡技術(shù)等途徑加工而得到的細(xì)胞外基質(zhì)替代物。其優(yōu)點(diǎn)是抗原性較弱，可降解，具有較好的可塑性和機(jī)械強(qiáng)度。缺點(diǎn)是降解產(chǎn)物為酸性，可能引起周圍組織非特異性炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。目前常見的耳郭軟骨人工合成材料包括多孔聚乙烯(Medpor)[21]、聚己內(nèi)酯(poly-caprolactone, PCL)[22]、聚羥基乙酸(poly-glycolic acid, PGA)[23]和聚乳酸(poly-lactic acid，PLA)[24]等。Medpor 是一種醫(yī)用級(jí)線性高密度多孔聚乙烯生物材料，具有優(yōu)良的組織相容性，其內(nèi)部縱橫交織的孔洞結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞增殖和新生肉芽及血管長(zhǎng)入，且材料強(qiáng)韌，立體感強(qiáng)，可切削，可免除患者切取自體軟骨的痛苦。主要缺點(diǎn)是材料質(zhì)地偏硬，再造耳郭缺乏柔韌可屈曲的生理特性，且容易產(chǎn)生壓迫性潰瘍并使支架外露。PCL、PGA和PLA是利用有機(jī)金屬化合進(jìn)行開環(huán)聚合而得到的脂肪族聚酯化合物，具有良好的柔韌性、抗磨損性能以及較高機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)可以被降解，取材容易。Dahlin[22]發(fā)現(xiàn)耳軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞能在PCL支架上增殖、分化，并修復(fù)小鼠的軟骨缺損。He 等[25]發(fā)明了一種熔斷電流體3D 打印技術(shù)，可制備出多層3D PCL組織工程支架，通過控制發(fā)射器的速度和運(yùn)動(dòng)方向可精細(xì)模擬出需要的幾何形狀和細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)。

2.3 復(fù)合材料 上述2類支架材料各有優(yōu)、缺點(diǎn)，例如膠原可逐漸降解，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供空間，但常常降解過快，生物力學(xué)特性不及人工合成材料[15]；而合成材料大多是疏水性的，組織相容性不及天然生物材料，而且酸性的降解產(chǎn)物會(huì)改變種子細(xì)胞增殖分化所需的微環(huán)境[26]。復(fù)合材料是指由2種或2種以上不同物質(zhì)以不同方式組合而成的材料，可發(fā)揮各個(gè)材料的優(yōu)點(diǎn)，克服單一材料的缺陷。Sterodimas等[27]將耳軟骨細(xì)胞與絲蛋白-藻酸鹽3D多孔耳郭支架共培養(yǎng)后植入兔皮下，6周后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞支架復(fù)合物有軟骨組織學(xué)表現(xiàn)，且絲蛋白-藻酸鹽耳郭支架能保持較完整的支架結(jié)構(gòu)和一定的彈性，僅邊緣輪廓有少部分吸收。Haaparanta 等[28]制備了膠原/PLA、殼聚糖/PLA和膠原/殼聚糖/PLA 3類3D多孔復(fù)合支架材料，研究發(fā)現(xiàn)膠原/PLA材料具有最好的親水性能且軟骨細(xì)胞在該3D支架上的滲透能力最好。Liu等[29]將PLA和PGA混合并制備類似人耳形狀的支架，發(fā)現(xiàn)20% PLA的加入可顯著提高PGA的力學(xué)性能，并且對(duì)PGA支架的細(xì)胞親和力、纖維結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。Lee等[30]制備了不同比例的聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)和絲蛋白(silk)復(fù)合支架，發(fā)現(xiàn)50∶50 的PVA-silk復(fù)合支架與單純支架相比具有更好的生物學(xué)相容性和力學(xué)強(qiáng)度，且PVA-silk植入大鼠皮下6周后仍能有較好的支架結(jié)構(gòu)。

3 展望

目前耳郭軟骨組織工程正在迅猛發(fā)展，選擇和改進(jìn)種子細(xì)胞和支架材料是優(yōu)化耳郭軟骨組織工程的關(guān)鍵，需要細(xì)胞生物學(xué)、工程材料學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等多學(xué)科的配合。

1997 年,Cao等[31]采用軟骨細(xì)胞復(fù)合PGA-PLA耳郭3D支架成功在裸鼠皮下構(gòu)建出具有人耳郭形態(tài)的組織工程軟骨，給耳郭重建領(lǐng)域翻開了新的一頁(yè)。很多學(xué)者開始著力于研究耳郭組織工程軟骨?，F(xiàn)在在體外或體內(nèi)成功構(gòu)建形態(tài)逼真的耳郭組織工程軟骨的技術(shù)日趨成熟，然而要應(yīng)用于臨床仍然面臨諸多挑戰(zhàn)：①種子細(xì)胞來源和分化的選擇，既要滿足構(gòu)建人耳郭軟骨的數(shù)量及質(zhì)量，還需要考慮到血管化、骨化等因素對(duì)軟骨組織的影響；②需要提高耳郭組織工程軟骨的力學(xué)性能和抗磨性能，有利于其對(duì)抗皮膚張力，維持自身特定形態(tài)，長(zhǎng)期保持耳郭的形狀；③因?yàn)樯L(zhǎng)因子誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的同時(shí)可能導(dǎo)致軟骨表型的缺失[5]，因此需要在軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜階段，時(shí)序性添加生長(zhǎng)因子以達(dá)到增殖與維持表型的雙重作用；④需要協(xié)調(diào)軟骨細(xì)胞再生與耳郭組織工程支架在體內(nèi)降解的速度，以免支架降解過快導(dǎo)致耳郭支架結(jié)構(gòu)的缺失；⑤需要大量且隨訪時(shí)間長(zhǎng)的動(dòng)物或人體實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證耳郭組織工程軟骨的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和安全性。目前絕大多數(shù)耳郭組織工程軟骨方面的研究仍停留在動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)階段，距離應(yīng)用于臨床尚有較大差距。耳郭組織工程軟骨領(lǐng)域的研究應(yīng)從種子細(xì)胞、生物材料、體外構(gòu)建技術(shù)等基礎(chǔ)科學(xué)問題入手，對(duì)目前存在的問題進(jìn)行針對(duì)性的深入研究，以逐步突破耳郭軟骨組織工程所面臨的困境。