王宇 王麗華 王健健 張薈雪

重癥肌無力(myasthenia gravis， MG)是指主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody， AChR-Ab)介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體和細(xì)胞因子參與，主要累及神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜乙酰膽堿受體(AChR)的獲得性自身免疫性疾病[1]，其臨床特點(diǎn)主要是活動(dòng)后加重、休息或應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑或免疫制劑治療后減輕，晨輕暮重的部分或全部骨骼肌無力和極易疲勞，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)肌無力危象而危及生命。MG的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。

近年來的多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)作為一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在各種自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病等)患者或動(dòng)物模型中表達(dá)異常，在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。目前，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究業(yè)已證實(shí)miR-146a、miR-155、miR-320a、miR-181c、let-7c、miR-125a-5p、miR-145、miR-15a、miR-15b、miR-19b等在MG的發(fā)病中具有重要意義，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)miR-20b、miR-21-5p、miR-23b、miR-27-3p、miR-29、miR-206、miR-223、miR-362-3p、miR-635、miR-151a-3p、miR-423-5p、let-7a-5p、let-7f-5p等多種新型miRNAs可能影響MG的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)有研究已證實(shí)miRNAs參與免疫細(xì)胞分化、增殖及抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子產(chǎn)生和分泌等一系列生物進(jìn)程。因此，了解MG中免疫相關(guān)miRNAs的研究進(jìn)展及其發(fā)病機(jī)制對(duì)MG 的診斷及治療有重大意義。本文將從miRNAs在MG中對(duì)T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子、B細(xì)胞及其補(bǔ)體、抗體等的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNA的生物合成及功能

miRNAs是一類內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，其種子序列通過與靶基因3′端非編碼區(qū)(untranslated regions， UTRs)特異性結(jié)合導(dǎo)致信使RNAs(messenger RNAs， mRNAs)降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，致使自身免疫性疾病發(fā)生和進(jìn)展。

miRNA基因首先在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成為沒有特定結(jié)構(gòu)的前體(稱為原始miRNA)，再由核糖核酸酶Ⅲ中的Drosha酶在核內(nèi)加工，產(chǎn)生大約65個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的發(fā)夾樣miRNA中間體，進(jìn)入胞質(zhì)后由其內(nèi)的Dicer酶(也是核糖核酸酶Ⅲ的一種)加工，產(chǎn)生成熟的單鏈miRNA。單鏈miRNA是RNA介導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的組成部分，其功能是引導(dǎo)RISC作用于特定mRNA，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與mRNA的3′-UTR序列相互作用，從而抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)或降解mRNA而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用[2]。一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)mRNAs，而同時(shí)一個(gè)mRNA也可以受到多個(gè)miRNAs的調(diào)節(jié)。

2 miRNA在MG相關(guān)T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子中的作用

2.1CD4+T細(xì)胞CD4+T細(xì)胞也稱為輔助性T細(xì)胞(helper T cell ，Th)，包括Th1、Th2和Th3細(xì)胞3個(gè)亞群。MG患者Th1和Th2細(xì)胞可能通過分泌細(xì)胞因子作用于AChR特異性B細(xì)胞，增強(qiáng)體液免疫活性，而Th3細(xì)胞主要通過分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)發(fā)揮其抑制性作用[3]。

2.1.1Th1細(xì)胞：Th1細(xì)胞特異性細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-12、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，特異性細(xì)胞因子，它們可以啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-2是其中最重要的一種，可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞增殖及產(chǎn)生IFN-γ、促進(jìn)B細(xì)胞增殖及分泌抗體，起免疫增強(qiáng)作用。IFN-γ刺激B細(xì)胞成熟并促進(jìn)AChR-Ab的產(chǎn)生、誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)臨床表現(xiàn)的產(chǎn)生。Cheng等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a在MG患者中表達(dá)下調(diào)；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-320a通過靶向調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)而參與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路誘導(dǎo)環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ的表達(dá)而參與MG的發(fā)病，該作者還認(rèn)為miR-320a有望成為MG新的治療靶點(diǎn)這一點(diǎn)。

2.1.2Th2細(xì)胞：Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-9、IL-10等細(xì)胞因子，可促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化和抗體的形成，啟動(dòng)體液免疫。其中IL-10是一種由T細(xì)胞B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子，具有抗炎和免疫抑制的作用。Jiang等[5]利用基因芯片技術(shù)對(duì)MG患者及健康人外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜檢測(cè)，與健康對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)MG患者存在多個(gè)差異表達(dá)的miRNAs。進(jìn)一步通過低通量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MG患者體內(nèi)misRNA let-7c顯著低表達(dá)，通過功能分析表明其能調(diào)控多個(gè)MG相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，尤其是let-7c可以通過負(fù)性調(diào)控IL-10的表達(dá)參與MG發(fā)病及進(jìn)展。

2.1.3Th3細(xì)胞：Th3細(xì)胞可以分泌一種內(nèi)源性免疫抑制性細(xì)胞因子TGF-β。該因子可以抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)；抑制B細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)及活化噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞增殖和分化并降低其活性；抑制IFN-γ、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的生成。有學(xué)者報(bào)道，MG患者PBMCs中TGF-β水平高于正常對(duì)照組，且TGF-β水平與病程有關(guān)[3]。T細(xì)胞中TGF-β信號(hào)通路缺失后大多數(shù)miRNAs表達(dá)下調(diào)，而miR-21及其他少數(shù)miRNAs表達(dá)上調(diào)。野生型小鼠B6T細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21后IFN-γ和TNF-α表達(dá)升高，部分模擬了TGF-β受體Ⅱ缺失小鼠的表型，誘發(fā)自身免疫性膽管炎和結(jié)腸炎[6]。TGF-β信號(hào)系統(tǒng)可以負(fù)性調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，敲除TGF-β信號(hào)后，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致miR-21過表達(dá)。MG患者血清中miR-21表達(dá)量也同樣增加[7]，其有可能通過上述機(jī)制導(dǎo)致MG起病。MG患者血循環(huán)中的miR-20b負(fù)性靶向調(diào)控IL-8、IL-25表達(dá)，且糖皮質(zhì)激素治療數(shù)月后其表達(dá)量可恢復(fù)正常[8]，然而其機(jī)制并不明確，同時(shí)有研究表明miR-20b在非小細(xì)胞肺癌中可以直接抑制TGF-β受體Ⅱ減弱TGF-β信號(hào)通路[9]，推測(cè)miR-20b很可能通過作用于TGF-β信號(hào)通路調(diào)節(jié)IL-8和IL-25表達(dá)，促使MG的發(fā)生。但miR-20b和miR-21是否通過調(diào)控細(xì)胞因子TGF-β的分泌和表達(dá)導(dǎo)致MG發(fā)病這一問題仍有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2Treg細(xì)胞人類自身免疫疾病通常具有Treg細(xì)胞相對(duì)缺乏的特點(diǎn)。體內(nèi)大部分Treg細(xì)胞產(chǎn)生于正常胸腺組織，叉頭框P3(Fork head box P3， FOXP3)是Treg細(xì)胞的生成及行使免疫抑制功能的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能喪失[10]。FOXP3表達(dá)下調(diào)可使胸腺自身免疫耐受機(jī)制遭到破壞，引發(fā)胸腺瘤患者發(fā)生包括MG在內(nèi)的自身免疫性疾病?，F(xiàn)有研究表明，miR-125a-5p在MG的FOXP3表達(dá)中重要具有調(diào)節(jié)作用。Li等[11]利用新一代基因測(cè)序技術(shù)和低通量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MG伴胸腺瘤患者胸腺內(nèi)miR-125a-5p顯著高表達(dá)；共轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)結(jié)果表明miR-125a-5p與FOXP3存在靶點(diǎn)關(guān)系；miR-125a-5p對(duì)FOXP3有明顯的下調(diào)作用；進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p負(fù)性調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，更加證實(shí)miR-125a-5p對(duì)基因FOXP3的調(diào)控作用。由上可見，在MG伴胸腺瘤患者胸腺組織中miR-125a-5p可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)FOXP3表達(dá)，引起Treg細(xì)胞的功能失調(diào)，導(dǎo)致自身免疫調(diào)節(jié)的失衡，參與MG的發(fā)病過程。

2.3Th17細(xì)胞除CD4+T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子外，還有另一種細(xì)胞亞群參與誘導(dǎo)MG的發(fā)生，這類細(xì)胞被稱為Th17細(xì)胞?，F(xiàn)有研究表明，多種miRNAs調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的生物進(jìn)程或IL-17等的分泌，可導(dǎo)致MG的發(fā)生和進(jìn)展。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-15a參與調(diào)節(jié)MG患者炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)在MG患者體內(nèi)干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白10(CXCL10)是miR-15a的一個(gè)直接靶基因；miR-15a的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致CXCL10的表達(dá)上調(diào)，增加IL-17、IFN- γ的表達(dá)。國(guó)內(nèi)一研究組制備EAMG大鼠動(dòng)物模型，首先采用微陣列方法檢測(cè)EAMG大鼠模型和健康大鼠PBMCs中miRNAs的表達(dá)譜，確認(rèn)了11種兩組間差異表達(dá)的miRNAs；進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-145在EAMG大鼠模型體內(nèi)表達(dá)量顯著下調(diào)，并導(dǎo)致其兩個(gè)靶蛋白CD28和NFATc1過表達(dá)，從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖和Th17細(xì)胞分化[13]。另一項(xiàng)研究表明MG患者PBMCs內(nèi)miR-181c的低表達(dá)導(dǎo)致IL-7和IL-17的高表達(dá)，從而導(dǎo)致MG發(fā)生[14]。MiR-19b-5p作為一種致癌性調(diào)節(jié)因子在MG伴胸腺瘤患者中高表達(dá)，其負(fù)性調(diào)控胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素的表達(dá)，從而影響Th17細(xì)胞的發(fā)育以及相關(guān)細(xì)胞因子包括IL-17、IL-1β、IL-6和IL-23的分泌，推測(cè)將來miR-19b-5p有可能成為MG和胸腺瘤的診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[15]。

3 miRNA在MG相關(guān)B細(xì)胞及補(bǔ)體的作用

B細(xì)胞起源于骨髓，發(fā)育成熟后進(jìn)入人體各個(gè)外周淋巴器官，它是體液免疫的主要細(xì)胞。某些miRNAs表達(dá)異常，導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)量變化、功能缺陷或過度激活等。其相關(guān)補(bǔ)體和細(xì)胞表面分子也發(fā)生紊亂，從而出現(xiàn)大量自身抗體的釋放，攻擊NMJ處的結(jié)構(gòu)，引起MG的發(fā)生發(fā)展。

3.1CD19CD19是主要表達(dá)于B細(xì)胞膜中的一種跨膜蛋白，是B細(xì)胞抗原識(shí)別與攝取狀態(tài)的關(guān)鍵標(biāo)記物。它通過介導(dǎo)活化B細(xì)胞與抗原間的作用來維持B細(xì)胞的活性。Lu等[16]研究miR-146a在MG的作用時(shí)，從C57BL/6小鼠體內(nèi)提取CD19+B細(xì)胞供體外實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。Zhang等[17]對(duì)B細(xì)胞miR-146a的基因沉默與EAMG治療機(jī)制相關(guān)性進(jìn)行研究時(shí)，同樣使用CD19磁珠提純B細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。目前仍沒有對(duì)CD19-B細(xì)胞在MG作用機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行對(duì)比，但不可否認(rèn)CD19作為跨膜蛋白在MG中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

3.2B細(xì)胞活化因子受體(BAFF-R) BAFF-R屬于腫瘤壞死因子受體家族的一員，主要功能是介導(dǎo)B細(xì)胞分化和增殖，并維持B細(xì)胞存活。有研究表明MG患者血清中BAFF-R表達(dá)增多，外周血中CD19+BAFF-R+B細(xì)胞明顯增加，提示其可能與MG發(fā)病機(jī)制有關(guān)，故該研究者提出一模型假說，認(rèn)為“活化的BAFF/BAFF-R信號(hào)通路激活NF-κB從而導(dǎo)致EAMG/MG 中miR-146a表達(dá)的異?！盵17]。Wang等[18]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明miR-155沉默后損害BAFF-R信號(hào)通路，減少NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而緩解EAMG的表現(xiàn)，表明miR-155的低表達(dá)對(duì)治療人類MG具有一定的意義。

3.3CD40、CD80、CD86T細(xì)胞驅(qū)使B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體需要抗原信號(hào)與共刺激信號(hào)兩個(gè)系統(tǒng)。共刺激分子包括CD40、CD80、CD86，它們可以參與細(xì)胞活化過程中的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控B細(xì)胞增殖、分化和凋亡[19]?，F(xiàn)有研究表明，miR-146a可能在AChR特異性B細(xì)胞活動(dòng)調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，從而導(dǎo)致MG的發(fā)病。Lu等[16]研究表明與健康對(duì)照組相比，MG患者miR-146a的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞表面共刺激分子和Toll樣受體4、NF-κB蛋白水平顯著減少。Zhang等[17]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明miR-146a敲除后出現(xiàn)多種B細(xì)胞功能缺陷，包括B-1細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)量下降，CD40、CD80、CD86表達(dá)下調(diào)，血清AChR-Ab表達(dá)及抗體類型轉(zhuǎn)換受損，緩解EAMG肌無力癥狀，故沉默miR-146a可能成為治療MG的有效方法。

4 miRNA在MG相關(guān)抗體中的作用

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在主要的MG相關(guān)抗體，如AChR-Ab、抗骨骼肌酪氨酸激酶(muscle specific tyrosine kinase antibody， MuSK)抗體、抗低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP4)抗體和抗肌聯(lián)蛋白(Titin)抗體中可能均具有一定調(diào)節(jié)作用。

4.1AChR-AbAChR是MG中的最主要的自身抗原，臨床上發(fā)現(xiàn)60%～80%MG患者存在AChR-Ab。現(xiàn)有研究表明，miR-146a在MG患者AChR-Ab調(diào)節(jié)中發(fā)揮了一定作用。Lu等[16]體外模擬MG的發(fā)病機(jī)制，使用電鰻AChR-α 146-162片段刺激B細(xì)胞，證明鼠AChR特異性B細(xì)胞接受刺激后miR-146a顯著高表達(dá)，且該現(xiàn)象可被AntagomiR-146a所削減。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，建立的EAMG動(dòng)物模型中敲除B細(xì)胞miR-146a后，AChR-Ab產(chǎn)生及抗體類別轉(zhuǎn)換將減少，可見miR-146a可能通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞活性、AChR-Ab產(chǎn)生及類別轉(zhuǎn)換導(dǎo)致MG的發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155也可能通過調(diào)節(jié)AChR-Ab類別轉(zhuǎn)換導(dǎo)致MG的發(fā)生。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)，全身型MG患者外周血B細(xì)胞中miR-155的相對(duì)表達(dá)量高于健康對(duì)照組，且地塞米松干預(yù)組miR-155相對(duì)表達(dá)量低于PBS 組，其培養(yǎng)上清中抗AChR-IgG1的水平也低于 PBS組，可見糖皮質(zhì)激素可以抑制全身型MG患者miR-155的表達(dá)，推測(cè)其可能是通過調(diào)節(jié)AChR-Ab類別轉(zhuǎn)換發(fā)揮治療作用。

4.2MuSK-Ab與AChR-Ab不同， MuSK-Ab的主要成分是IgG4，而不是IgG1。IgG4通過干擾LRP4-MuSK的結(jié)合來抑制MuSK的激活，這也被認(rèn)為是MuSK-Ab致病的主要機(jī)制之一[21]。MuSK-Ab陽性MG患者約占MG患者總數(shù)的5%～7%。Punga等[22]為了證實(shí)MuSK-Ab陽性MG患者血清中是否存在特異性的miRNAs進(jìn)行了一項(xiàng)研究。研究表明let-7a-5p、let-7f-5p、miR-151a-3p和miR-423-5p明顯高表達(dá)，這些miRNAs有可能成為除抗體滴度以外MuSK-Ab陽性MG患者血清特異性的生物標(biāo)志，但尚需進(jìn)一步深入研究。

4.3抗LRP4抗體和抗Titin抗體近年研究發(fā)現(xiàn)，LRP4是Agrin-LRP4-MuSK-Dok7信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分。它與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元釋放的集聚蛋白Agrin結(jié)合后可激活MuSK，并導(dǎo)致AChR的聚集，進(jìn)而促進(jìn)NMJ的形成。小部分MG患者血清AChR-Ab和MuSK-Ab均呈陰性，這部分MG被稱之為血清雙陰性重癥肌無力。在血清雙陰性重癥肌無力患者中檢測(cè)出LRP4-Ab陽性[23-24]。Titin抗體屬于橫紋肌抗體的一種，研究發(fā)現(xiàn)重癥MG患者血清Titin-Ab比輕癥者容易檢測(cè)到，說明MG嚴(yán)重程度與Titin-Ab滴度有一定的相關(guān)性，并且Titin-Ab與胸腺瘤密切相關(guān)[25]。目前，與此兩種抗體相關(guān)的研究尚少，miRNA對(duì)其的作用尚待研究。

綜上可見，MG是一種神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病，其免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制備受關(guān)注，包括自身抗體的產(chǎn)生、免疫細(xì)胞功能受損以及其分泌的細(xì)胞因子失衡等。miRNA作為一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在MG發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其中miR-146a、miR-155等有望成為MG治療靶點(diǎn)。因此，研究miRNA在MG免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的作用，可為臨床分子診斷和個(gè)體化治療提供新思路。目前，如何精確地通過相關(guān)技術(shù)檢測(cè)MG特異性miRNA及其靶基因，并在miRNA水平上闡述MG的發(fā)病機(jī)理，仍然是未來研究的一大難題。分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展將會(huì)促進(jìn)對(duì)MG免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和探討，為其臨床治療提供新策略。

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