徐順明， 曹艷云， 孔 偉， 徐 徉， 蔡海斌

上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院皮膚科,上海 201299

慢性自發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria, CSU)是指風團與血管性水腫自發(fā)性表現(xiàn)超過6周的慢性蕁麻疹[1]。CSU是一種炎癥性疾病，可由免疫、遺傳和環(huán)境因素(包括感染)的相互作用引起[2]，患者血清中存在多種炎癥標志物的異常改變。CSU患者血清中C反應蛋白(C-reaction protein, CRP)也存在一定變化，但臨床意義尚不明確。

因此，本研究采用同位素標記相對與絕對定量(isobaric tag for relative absolute quantitation，iTRAQ)技術對風團持續(xù)時間不同的CSU患者血清進行差異蛋白鑒定，探討CSU患者血清CRP水平與風團持續(xù)時間的相關性。

1 資料與方法

1.1 入選及排除標準 2015年7月至2016年8月我院收治的CSU患者納入研究范圍。入選標準：年齡18～65歲，風團單個皮損持續(xù)時間小于24 h，風團反復發(fā)作病程超過6周，且每天或幾乎每天發(fā)作，符合慢性自發(fā)性蕁麻疹診斷標準；患者就診時觀察到有風團存在。排除標準：有過敏性鼻炎、哮喘、特應性皮炎等過敏性疾病史和寄生蟲感染史；妊娠及哺乳期婦女；伴血管性水腫、可誘導性蕁麻疹；嚴重的系統(tǒng)性疾病、吸毒和酗酒者；就診前3 d內(nèi)使用過抗組胺藥物，1個月內(nèi)使用過皮質類固醇激素、免疫抑制劑、止血或抗凝血藥。本研究通過我院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有患者及健康對照均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 伯樂公司Protein Miner去除高豐蛋白的試劑盒，iTRAQ同位素定量試劑盒；高pH反相色譜分離：柱子信息為2.1×150 mm X Bridge BEH300(Waters公司，加拿大)；色譜儀器為Waters公司UPLC高效液相色譜；第二維反相液質聯(lián)用RPLC-MS：數(shù)據(jù)采集軟件為Analyst TF (Sciex公司，加拿大)；反相柱信息：ZORBAX 300SB-C18 column(5 μm, 300?, 0.1×150 mm，Microm，美國)；Eksigent 1D plus色譜儀，Triple TOF 5600質譜儀(Sciex公司，加拿大)。免疫散射比濁法檢測儀為普門科技PA-990。

1.3 血清差異蛋白的鑒定

1.3.1 研究對象及分組 20例CSU患者病程2個月～48個月，根據(jù)風團持續(xù)時間分為2組：風團持續(xù)時間<2 h組(n=10)，其中男性3例，女性7例，年齡20～48歲；風團持續(xù)時間12～24 h組(n=10)，其中男性7例，女性3例，年齡26～61歲。另選10例來自本院的健康體檢者作為健康對照組，男性5例，女性5例，年齡22～54歲。

1.3.2 標本采集及測定 標本采集：2組CSU患者和健康對照者各抽血5 mL，靜置后4 000 r/min(r=10 cm)，離心5 min，留取上清，分組按序編號，-80℃保存待測；血清處理：血清標本同批次檢測，采用ProteoMiner Large-Capacity試劑盒去除高豐度蛋白，洗脫下來的樣品通過Bradford法進行定量；利用胰酶對各組蛋白質分別進行酶解；利用iTRAQ試劑盒對各組蛋白進行定量標記，把標記完的樣品混合；混合后的蛋白進行2次二維液相色譜質譜分析；利用Mascot軟件分析質譜數(shù)據(jù)，采用Paragon算法來執(zhí)行數(shù)據(jù)庫搜索。蛋白質檢索數(shù)據(jù)庫為HumanSwissProt。進一步篩選差異蛋白進行后續(xù)分析。所有實驗包含2次技術重復。

1.4 CRP水平的檢測 在差異蛋白鑒定后，選取63例CSU患者，根據(jù)風團持續(xù)時間分為2組：每天風團持續(xù)時間<2 h者29例，發(fā)病以來每天風團發(fā)作持續(xù)時間12～24 h者34例。另選健康體檢者作為健康對照組33例。免疫散射比濁法檢測方法：3組血清標本采集如前，血清標本同批次檢測，按試劑盒說明書進行檢測。

2 結 果

2.1 各組間差異蛋白表達情況 結果表明：3組間存在不同數(shù)量的蛋白表達差異。與健康對照組相比，風團持續(xù)時間12～24 h組患者的差異表達蛋白有20個，其中上調5個，下調15個；風團持續(xù)時間小于2 h組患者的差異蛋白共有31個，上調12個，下調19個。風團持續(xù)時間12～24 h組/健康對照組間及風團持續(xù)時間<2 h組/健康對照組間共同的差異蛋白有14個，包括上調蛋白5個和下調蛋白9個。與風團持續(xù)時間<2 h組相比，風團持續(xù)時間12～24 h組的差異蛋白18個，其中上調4個，即CRP、serum amyloid P-component (SAP)、monocyte differentiation antigen CD14和putative protein FAM10A5；下調14個，包括tropomyosin alpha-4 chain (TM30p1)、keratin-14、Ig gamma-4 chain C region、immunoglobulin kappa variable 1D-33、hemopexin、pleckstrin、cofilin-1、complement factor H-related protein 2、cytokeratin-2e (CK-2e)、cytokeratin-9(CK-9)、actin、cytokeratin-1(CK-1)。3組間CRP均為上調蛋白，但CRP在風團持續(xù)時間12～24 h組的比值最高；而風團持續(xù)時間12～24 h組和健康對照組患者CRP比值相近。

2.2 CSU患者與健康對照組血清CRP水平的比較 結果表明：風團持續(xù)時間<2 h組、風團持續(xù)時間12～24 h組、健康對照組CRP水平分別為(0.865±2.120)、(3.727±8.416)、(0.447±0.674)mg/L，組間差異有統(tǒng)計學意義(F=3.9705，P<0.05)。風團持續(xù)時間<2 h組患者CRP水平與風團持續(xù)時間12～24 h組、健康對照組間均無明顯差異，而后兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

CSU危害生命的風險低，但對患者生活質量的影響很大[3]。臨床上，由于病因和發(fā)病機制不同，風團持續(xù)時間各不相同，部分患者風團持續(xù)時間<2 h可自行消退，另有部分患者風團持續(xù)12～24 h方可消退，伴有明顯瘙癢，給患者帶來了痛苦。目前尚無有效的方法判斷患者風團的持續(xù)時間，對于風團發(fā)生后的持續(xù)時間，也無明確的劃分標準，有分為2 h內(nèi)和超過2 h者，以及<24 h和超過24 h者[4]。本研究分為風團持續(xù)時間<2 h及風團持續(xù)時間12～24 h進行對比研究。

蛋白質組學技術在CSU研究領域應用較少。本研究采用iTRAQ技術對風團持續(xù)時間不同的CSU患者和健康對照者之間血清進行蛋白表達研究，結果表明3組間存在差異表達蛋白。進一步比較組間差異蛋白，結果發(fā)現(xiàn)14種蛋白為共同差異蛋白。這些蛋白是否與風團發(fā)作及風團發(fā)作持續(xù)時間有關尚不清楚。目前已經(jīng)確認了CSU具有多種潛在的標志物[5]。風團的形成，尤其是持續(xù)時間長、不易消退的風團形成機制十分復雜，參與風團形成的血生物標志物更多[6]。本研究鑒定的共同差異蛋白在風團形成與消退的過程中有無作用及如何發(fā)揮作用有待進一步的研究探討。

CRP是經(jīng)典補體級聯(lián)反應的強活化劑，可在某些條件下開始或加劇炎性病變[7]。CSU患者血清CRP是否增高一直存有爭議[8-12]。本研究結果表明，與健康對照相比，CSU患者血清中的CRP均為上調蛋白，說明CRP表達與CSU風團發(fā)作有關。CRP在風團持續(xù)時間12～24 h組患者中表達最明顯，提示CRP表達與風團持續(xù)時間有關，風團持續(xù)時間長，血清CRP表達上調明顯，風團持續(xù)時間短，血清CRP雖有上調表達，但不明顯。經(jīng)免疫散射比濁法進一步檢測，風團持續(xù)時間長的CSU患者血清CRP水平高于健康對照，差異有統(tǒng)計學意義，而風團持續(xù)時間短的CSU患者血清CRP水平與健康對照組間無差異。這一結果提示，風團持續(xù)時間長的CSU患者血清CRP可作為炎癥性標志物，而在風團持續(xù)時間短的CSU可能不具有炎癥性標志物的價值。

綜上所述，本研究通過iTRAQ技術檢測風團持續(xù)時間不同的CSU患者血清的差異蛋白，試圖尋找不同的風團形成過程中的蛋白質差異，為研究CSU的發(fā)病機制和診療手段提供線索。研究結果提示，CSU患者血清CRP表達與風團持續(xù)時間有關，風團持續(xù)時間較長的CSU患者血清CRP水平高于健康對照。血清CRP在風團持續(xù)時間長的CSU患者中具有炎癥性標志物的意義。

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