孫華偉，盧鳳英，張敬峰，張曉曦，徐 凱，劉傳敏，張小飛

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省農(nóng)科院動(dòng)物疫病診斷檢測(cè)中心，江蘇 南京 210014）

影子病在人醫(yī)領(lǐng)域研究較多，在獸醫(yī)領(lǐng)域研究少之又少。何謂影子??？指的是感染某種疾病后，患另一種疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，后一種疾病如同前一種疾病的影子，醫(yī)學(xué)專家形象地稱之為影子病[1]。為什么會(huì)有影子??？因?yàn)樯眢w是一個(gè)有機(jī)整體，各系統(tǒng)相互關(guān)聯(lián)和影響，使得一些看似不相關(guān)的疾病常常互為“影子”。副豬嗜血桿菌(HPS)常被稱為豬藍(lán)耳病(PRRS)的影子病[2]，但極少有文獻(xiàn)報(bào)道兩者之間相關(guān)性的確切數(shù)據(jù)。遂對(duì)江蘇省農(nóng)科院動(dòng)物疫病診斷檢測(cè)中心2017年5-8月份臨床接診的32份豬樣品同時(shí)進(jìn)行PRRSv與HPS的檢測(cè)。具體報(bào)告如下：

1 材料

1.1 檢測(cè)地點(diǎn)與檢測(cè)時(shí)間

PRRSV的PCR檢測(cè)和HPS的檢測(cè)于2017年8月在江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所動(dòng)物疫病診斷檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要試劑及儀器

PCR 儀（Applide Biosystems）購(gòu)自ABI公司；Tanon凝膠成像系統(tǒng)（2500）購(gòu)自上海天能公司；電泳儀（cavoy）購(gòu)自凱元信瑞儀器公司；冷凍離心機(jī)型號(hào)為Centrifuge5424R，產(chǎn)自德國(guó)；生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；生物安全柜購(gòu)自蘇凈集團(tuán)保護(hù)氣氛有限公司；胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購(gòu)買美國(guó)BD公司；NAD（氧化型輔酶Ⅰ）購(gòu)自南京奧多福尼生物科技有限公司；新生小牛血清，購(gòu)自上海語(yǔ)純生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑為進(jìn)口產(chǎn)品或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品；各種規(guī)格移液器，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 檢測(cè)試劑盒

核酸提取及PCR試劑盒；Axy-Prep體液病毒DNA小量試劑盒購(gòu)自康寧公司；PCR試劑盒等購(gòu)自上海Sangon公司。

1.4 引物

1.4.1 PRRSV引物

參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，該對(duì)引物的擴(kuò)增目的片段大小為372 bp，見表1。

1.4.2 HPS引物

參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，該對(duì)引物的擴(kuò)增目的片段大小為822 bp，見表2。

2 方法

2.1 樣品PRRSV的檢測(cè)

待檢樣品PRRSV核酸的提取及PCR過(guò)程嚴(yán)格按照Sangon公司的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行相關(guān)操作。

2.2 樣品HPS的檢測(cè)

TSA平板、TSB肉湯配制時(shí)，分別添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）終濃度為10 mg/L和犢牛血清（終濃度50 mL/L）。燒灼剪刀、接種環(huán)，無(wú)菌采集現(xiàn)場(chǎng)剖殺的新鮮豬肺臟、心血接種涂抹于TSA平板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察平板，挑取表面光滑、邊緣圓滑、針尖大小成露珠樣的單個(gè)菌落進(jìn)一步純化。將疑似的單個(gè)菌落進(jìn)行涂片、固定、染色，油鏡下觀察。對(duì)分離菌株進(jìn)行DNA提取，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳；用膠回收試劑盒回收陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品PRRSV的PCR檢測(cè)結(jié)果

共檢測(cè)臨床樣品32份，其中檢出PRRSV陽(yáng)性樣品12份，檢測(cè)樣品的PRRSV病原陽(yáng)性率為37.5%；部分樣品的電泳圖見圖1。

表1 PRRSV引物序列信息

表2 HPS引物序列信息

圖1 部分樣品PRRSV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3.2 HPS檢測(cè)結(jié)果

3.2.1 HPS的菌落形態(tài)

見圖2和圖3。

圖2 HPS在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)

圖3 HPS在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)

HPS在TSA 平板上生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)24 h 后，生長(zhǎng)出邊緣整齊、光滑、透明的針尖大小的菌落，菌落直徑約0.3～1.2 mm。

3.2.2 HPS的細(xì)菌形態(tài)

見圖4和圖5。

圖4 HPS革蘭氏染色后的細(xì)菌形態(tài)

圖5 HPS革蘭氏染色后的細(xì)菌形態(tài)

取上述經(jīng)純化的菌落涂片，革蘭染色后在顯微鏡下觀察，見革蘭陰性桿菌，具有多種形態(tài)，從短桿狀、細(xì)長(zhǎng)桿狀到細(xì)長(zhǎng)絲狀不等，多數(shù)細(xì)菌形態(tài)為略微彎曲桿狀。

3.2.3 分 離 菌 株 16SrRNAPCR檢測(cè)

見圖6。

圖6 分離菌株 16S rRNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，分離菌株經(jīng)PCR檢測(cè)擴(kuò)增出大小為822 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖6)。用膠回收試劑盒回收陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（測(cè)序結(jié)果未列出），并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用在線軟件Nucleotide Blast進(jìn)行比對(duì)分析。發(fā)現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)測(cè)序序列同源性最高的10個(gè)序列均為NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)布的HPS 16SrRNA基因序列，其同源性都在98%以上，可判定為HPS。

4 討論

HPS和PRRS常常以混合感染或繼發(fā)感染的形式發(fā)生[3]，為什么HPS被稱為PRRS的影子病，而不是豬鏈球菌、豬傳染性胸膜放線桿菌等別的細(xì)菌？說(shuō)明豬群感染PRRS以后，感染HPS的幾率更大，本次檢測(cè)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，本次檢測(cè)的32份樣品共分離到3例豬鏈球菌，未分離到豬傳染性胸膜放線桿菌，豬鏈球菌和豬傳染性胸膜放線桿菌的檢出率明顯低于HPS。人類醫(yī)學(xué)研究顯示： “影子病”的發(fā)生有兩大原因：一是一種疾病導(dǎo)致的損傷引發(fā)了第二種疾??；二是有缺陷的基因觸發(fā)了另一種疾病。豬群感染PRRS以后很容易繼發(fā)感染HPS的分子生物學(xué)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

目前HPS的臨床發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于分離率，原因在于HPS體外培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求較高[4]，培養(yǎng)基中需要加入NAD（氧化型輔酶Ⅰ）[5]和牛血清；且HPS抵抗力不強(qiáng)，在體外很容易死亡，分離時(shí)，病料必須是新鮮的組織，不能凍存，采集的病料在冷藏條件下不能超過(guò)1周[6]；細(xì)菌分離鑒定時(shí)應(yīng)當(dāng)采集處于病急性期的豬并且沒有使用抗生素的病料[7]，否則分離率大大降低。

目前防治副豬嗜血桿菌病的主要方法是抗生素的應(yīng)用及滅活疫苗的使用。但隨著抗生素的長(zhǎng)期使用，HPS的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，藥物治療對(duì)副豬嗜血桿菌病的防治已愈發(fā)困難，HPS發(fā)病嚴(yán)重的豬場(chǎng)，使用疫苗來(lái)預(yù)防是可選方案[8]。

[1] 蘭曉雁.健康關(guān)鍵詞：影子病[J].健康生活，2016（1）：11-12.

[2] 葉飛，賀云霞，徐慧，等.副豬嗜血桿菌病研究進(jìn)展 [J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展，2011，32（2）101-104.

[3] MACLNNES J I，GOTTSCHALK M，LONE A G，et al. Prevalence of Actinobacillus pleuropneumoniae，Actinoba-cillus，Haemophilus parasuis，Pasteurella multocida，and Streptococcus suis inrepresentative Ontario swine herds [J] .Can J Vet Res，2008，72(3)：242-248.

[4] 李曦婷，王超，薛彥杰，等.一例副豬嗜血桿菌的分離鑒定及16SrRNA生物信息學(xué)分析[J] .沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，47（4）：438-444.

[5] KIELSTEINA P， WUTHEB H H，ANGENC O.Phenotypic and genet-ic characterization of NAD dependent Pasteurella ceae from the respiratory tract of pigs and their possible pathogenetic importance [J].Vet Microbiol，2001，81：243-255.

[6] 王建，邵衛(wèi)星，呂占軍，等.2012年我國(guó)部分省市規(guī)?；i場(chǎng)副豬嗜血桿菌分離鑒定及菌株血清分型[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（3）：48-52.

[7] 魏鳳，張文通，李峰，等.副豬嗜血桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述[J].豬業(yè)科學(xué)，2017.34（5）：54-55.

[8] 易新健，王小波，高清清，等.蘇皖地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離鑒定與三價(jià)滅活疫苗的初步研制[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017.37（5）：823-827.