劉 穎 劉春雨 曹廣超 王彥多 王集會 史 磊

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

科技進(jìn)展

《AdvancesinScience&Technology》

美洲大蠊粉發(fā)酵前后水溶性活性物質(zhì)含量對比研究

劉 穎 劉春雨 曹廣超 王彥多 王集會 史 磊

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

用水提法提取發(fā)酵前后美洲大蠊粉中的水溶活性物質(zhì)，再分別采用定磷法、苯酚-硫酸法、改良Lowry 法測定總核酸、總糖、總蛋白質(zhì)的含量，然后比較發(fā)酵前后的美洲大蠊粉中水溶性活性物質(zhì)含量之間的差異?？芍l(fā)酵前樣品中總核酸含量為33.800 1 mg/g，總糖含量為14.187 3 mg/g，總蛋白質(zhì)含量為100.016 6 mg/g，發(fā)酵后樣品中總核酸含量為22.834 5 mg/g，總糖含量為11.024 9 mg/g，總蛋白質(zhì)含量為197.493 6 mg/g。

美洲大蠊 發(fā)酵對比 總核酸 總糖 總蛋白

美洲大蠊Periplanetaamericana(L.)是一類有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，民間稱之為蟑螂，早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。大多以鮮成蟲或干燥體入藥，作為傳統(tǒng)的中藥材，其性味寒咸，具備散瘀、解毒、消腫、利水、消積等功用?，F(xiàn)有臨床研究證實，美洲大蠊在抗腫瘤、促進(jìn)組織修復(fù)、抗氧化、抗菌抗病毒等方面有明顯作用[2]。在本實驗中，通過分別用定磷法[3]、苯酚-硫酸法[4]和改良Lowry法[5]對發(fā)酵前后的美洲大蠊粉中總核酸、總糖和總蛋白質(zhì)含量的測定，奠定了下一步美洲大蠊藥理性實驗研究的基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ-500E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ST16R高速冷凍離心機( 賽默飛世爾科技有限公司)；UV9100B型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；disb-zc型低溫冷卻循環(huán)水真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FA11-4N 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；766-2型遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)。

1.2 試劑

牛血清蛋白(BSA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；堿性銅(用酒石酸鉀鈉、無水碳酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉(皆為分析純)自制)；福林酚試劑( 批號: HCRB110320，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；無水葡萄糖;濃硫酸；苯酚；磷酸二氫鉀；定磷試劑(用濃硫酸、鉬酸銨、抗壞血酸(皆為分析純)自制)。美洲大蠊粉(批號:20160901)購自山東省臨沂市沂水縣，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系高德民副教授鑒定為蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬美洲大蠊Periplanetaamericana(L.)；發(fā)酵美洲大蠊粉( 批號:20161101)由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗室自制。

2 實驗方法

2.1 發(fā)酵美洲大蠊粉的制備

稱取適量美洲大蠊粉，加入活白僵菌孢子粉(100億/g，山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所自篩菌株-桃5)，加少量吐溫-80，用75%乙醇稀釋其成為含1×108個孢子的懸濁液。取適量懸濁液拌勻濕潤，溫度保持為25℃～28℃，濕度保持為95%，在恒濕恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d左右，待菌絲長滿后停止發(fā)酵。

2.2 美洲大蠊粉水提液的制備

精密稱取美洲大蠊粉、發(fā)酵美洲大蠊粉各0.5 g于具塞錐形瓶中，加入15 mL蒸餾水，加塞超聲20 min，抽濾后取殘渣再重復(fù)上述步驟2次。將3次的提取液混合均勻，離心(3 000 r/min)10 min，再次抽濾，將抽濾液用50 mL容量瓶定容，得美洲大蠊粉水溶性提取物溶液。發(fā)酵前后美洲大蠊粉各水提3次。

2.3 定磷法測定總核酸的含量

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取磷酸二氫鉀(在110 ℃下烘干至恒重)0. 877 5 g 于100 mL燒杯中，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶，定容。再精密量取5.00 mL上述溶液，用100 mL容量瓶定容，配制為含磷20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)磷溶液。

2.3.2定磷試劑的制備

將蒸餾水、17%硫酸溶液、10%抗壞血酸溶液、2.5%鉬酸銨溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)按體積比為2∶1∶1∶1配制成定磷試劑。

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別量取標(biāo)準(zhǔn)磷溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于具塞試管中，補加蒸餾水至3.0 mL，再加入3.0 mL定磷試劑，混合均勻，加塞45 ℃水浴加熱10 min，同時做空白實驗，自然冷卻后在660 nm波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，磷的質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.020 7x-0.000 04，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。

2.3.3樣品含量測定

2.3.3.1總磷含量測定

準(zhǔn)確量取美洲大蠊粉水提液1.0 mL于5 mL小燒杯中，加入2.0 mL 10%硫酸溶液及2粒玻璃珠，于通風(fēng)櫥內(nèi)大火加熱至溶液為透明黑色(必須透明)，消化完成。冷卻后將消化液移入25 mL容量瓶中，用少量蒸餾水洗滌燒杯和玻璃珠2次，洗滌液一并移入容量瓶中，加蒸餾水至刻度線。準(zhǔn)確吸取3.0 mL上述溶液于具塞試管中，加入3.0 mL定磷試劑， 加塞在45 ℃水浴中加熱10 min，同時做空白實驗，自然冷卻后在660 nm波長處測定吸光度。發(fā)酵前后美洲大蠊粉水提溶液分別平行測定3次，根據(jù)回歸方程式計算出樣品中總磷含量。

2.3.3.2沉淀劑的制備

取鉬酸銨固體0.5 g，加入過氯酸7 mL及蒸餾水193mL溶解，得到沉淀劑。

2.3.3.3無機磷含量測定

分別準(zhǔn)確量取發(fā)酵前后樣品溶液1.0 mL，再加入沉淀劑9.0 mL，混合均勻，充分反應(yīng)后離心( 3500 r /min)15 min，取上清液5 mL，用25 mL容量瓶定容。精密量取3.0 mL 稀釋液于具塞試管中，加入定磷試劑3.0 mL，加塞45 ℃水浴加熱10 min，同時做空白實驗，自然冷卻，在660 nm波長處測定吸光度。發(fā)酵前后美洲大蠊粉水提溶液各平行測定3 次。根據(jù)回歸方程式計算出樣品中無機磷含量。

2.3.3.4有機磷和核酸含量測定

有機磷 = 總磷 - 無機磷。核酸分子中含有一定比例的磷，一般RNA 和DNA及其核苷酸含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9% 和9.2%，換算后可知核酸量約為含磷量的11 倍，故通過計算有機磷的量，可求得核酸的量。(見表1)

2.4 苯酚-硫酸法測定總糖的含量

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取干燥至恒重(兩次稱量誤差不超過0.3 mg)的葡萄糖10.0 mg于50 mL燒杯中溶解，用100 mL容量瓶定容，備用。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別準(zhǔn)確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度。再分別量取2 mL上述溶液于具塞試管中，加入5%苯酚溶液 (現(xiàn)配現(xiàn)用)1 mL，混合均勻，快速加入濃硫酸5 mL，室溫放置10 min后加塞40 ℃水浴保溫15 min，同時做空白實驗，在490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖的質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.128 9x+0.000 000 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1.

2.4.3樣品含量測定

精密量取2.2項下樣品1 mL定容于10 mL容量瓶中，取2mL于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，混合均勻后迅速加入濃硫酸5 mL，室溫放置10 min后加塞40 ℃水浴保溫15 min，同時做空白實驗，取出后于490 nm測定吸光度。發(fā)酵前后美洲大蠊粉水提溶液各平行測定3次。根據(jù)回歸方程計算樣品中總糖的含量。(見表1)

2.5 改良Lowry法測定總蛋白的含量

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取20.0 mg牛血清蛋白于50 mL燒杯中溶解，移入100 mL容量瓶中用蒸餾水定容得200 μg /mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于試管中，補加蒸餾水至1 mL，再加入堿性銅溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)5 mL，混合均勻后室溫放置10 min，快速加入福林酚試劑0. 5 mL，室溫放置30 min后在650 nm波長處測定其吸光度，同時設(shè)置空白實驗。以吸光度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.500 8x-0.003 7，相關(guān)系數(shù)r=0.998 6.

2.5.3樣品溶液的測定

精密量取美洲大蟾粉樣品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容。再精密量取1 mL置于試管中，加入堿性銅溶液5 mL，混合均勻，測定其吸光度，同時做空白實驗。發(fā)酵前后美洲大蠊粉水提溶液各平行測定3 次。根據(jù)回歸方程式計算出樣品中總蛋白含量。(見表1)

3 結(jié) 果

表1 發(fā)酵前后美洲大蠊粉水溶性活性物質(zhì)含量(x±s，mg/g)Table 1 content of water soluble active substances inPeriplaneta Americana powder before fermentation and after(x±s，mg/g)

由表可知發(fā)酵美洲大蠊粉的水提液中總核酸、總糖的含量均減少，而總蛋白質(zhì)的含量增多。

4 討 論

發(fā)酵是生物體運用自身調(diào)節(jié)來完成的，反應(yīng)的專一性強，得到的代謝產(chǎn)物單一性好。白僵菌屬于藥用真菌，其在液體發(fā)酵過程中，除了孢子或者菌絲大量增殖外，還會在發(fā)酵液中產(chǎn)生生物堿、多糖、維生素、多肽、酶、萜類化合物、甾醇、核酸、氨基酸和類抗生素作用的具備生理活性的多種物質(zhì)。這些物質(zhì)分別對心血管、腎臟、肝臟、性器官、神經(jīng)系統(tǒng)等具有防病治病的功效，此外還有抗癌、抗菌、抗炎、抗?jié)?、抗衰老等作用。人們對藥用真菌的液體發(fā)酵主要以獲取以上次生代謝產(chǎn)物為目的[6]。

實驗證明，美洲大蠊粉用白僵菌發(fā)酵后，蛋白質(zhì)的含量明顯增多，說明是由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來；核酸和總糖的含量減少，可能轉(zhuǎn)化為了大量的蛋白質(zhì)和少量的其他次生代謝產(chǎn)物(具體路徑有待考察)。由此說明美洲大蠊粉的發(fā)酵過程中，由白僵菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物主要為蛋白質(zhì)，其含量明顯增加約至一倍。而總糖和核酸的含量減少甚微，可忽略不計。這為下一步做發(fā)酵前后的美洲大蠊粉水提液抗腫瘤藥效對比的藥理實驗奠定了基礎(chǔ)。

[1] 何正春,彭芳,宋麗艷 等.美洲大蠊化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2007,(21):2 326～2 331.

[2] 羅廷順,高孟婷,馬芳芳 等.美洲大蠊藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(10):5 933～5 935+5 942.

[3] 劉春雨,劉玉慧,李曉輝 等.蜈蚣粉發(fā)酵前后水溶性活性物質(zhì)含量對比研究[J].湖南中醫(yī)雜志,2016,(11):167～169.

[4] 楊賢慶,劉名求,戚勃 等.龍須菜中多糖含量測定方法的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2013,(22):54～57.

[5] 閆萍,楊琦,王惠珍 等.改良Lowry法和Bradford法測定蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量的比較(英文)[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,(01):9～11.

[6] 李羿,楊勝,萬德光.藥用真菌液體發(fā)酵研究進(jìn)展及存在問題探討[J].中草藥,2012,(10):2 066～2 070.

ComparativeReasearchontheContentofWater-SolubleActiveSubstancesbeforeandafterFermentationofPeriplanetaAmericana

Liu Ying Liu Chunyu Cao Guangchao Wang Yanduo Wang Jihui Shi Lei

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Shandong Jinan 250355)

The water-soluble active substance in periplaneta Americana powder before and after fermentation was extracted with water. The total nucleic acid, total sugar, and total protein content were determined by the methods of fixed phosphorus, phenol-sulfuric acid method and the improved Lowry method and the differences of the water-soluble active substance content in periplaneta Americana powder were compared between before and after fermentation. The results showed that the content of total nucleic acid was 33.800 1 mg,the content of total sugar was 14.187 3 mg,and the content of total protein was 100.016 6 mg per gram before fermentation and 22.834 5 mg、11.024 9 mg、197.493 6 mg per gram after fermentation.

Periplaneta Americana fermentation comparison total nucleic acid total sugar total protein

10.16597/j.cnki.issn.1002-154x.2017.03.001

2017-02-12

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計劃資助項目(編號：2016016)。

劉穎，女，(1996～)，本科生，研究方向：制藥工程。E-mail：17854111049@163.com；通信作者：史磊，男，(1983～)，博士，助教，研究方向：中藥化學(xué)活性成分及中藥質(zhì)量控制研究，E-mail：15966605306@163.com。