楊正東 陳益民★ 劉永林 何一波

肺癌是全世界致死率最高的一種常見惡性腫瘤，每年約140萬人死于此?。?］。盡管肺癌的治療水平有較大進步，但大多數(shù)患者確診時已處于癌癥的后期，錯過了最佳治療時機，5年生存率僅10%～15%［2］。肺癌是一種多因素導致的疾病，目前我們對于肺癌的認識還顯著不夠，肺癌的發(fā)病機理﹑早期診斷及治療監(jiān)測等方面亟待提高。蛋白質(zhì)組學能從整體的角度闡明與肺癌相關(guān)的蛋白成分的變化，從而幫助我們從分子水平了解肺癌的發(fā)生﹑發(fā)展過程，這在肺癌的早期診斷﹑預后監(jiān)測及治療方面發(fā)揮重要作用。支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）作為理想的臨床標本在研究肺部疾病方面具有明顯優(yōu)勢，肺癌患者的BALF蛋白組學研究在解決肺癌這一難題上具有更廣闊前景。

1 BALF蛋白組學

1.1 BALF的介紹 2002年中華醫(yī)學會呼吸學會制定的《支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術(shù)規(guī)范草案》中關(guān)于BALF的臨床操作步驟為：（1）首先在要灌洗的肺段經(jīng)活檢孔通過一細硅膠管注入2%利多卡因1～2ml做灌洗肺段局部麻醉。（2）然后將纖支鏡頂端緊密楔入段或亞段支氣管開口處，再經(jīng)活檢孔通過硅膠管快速注入37℃滅菌生理鹽水，每次25～50ml，總量 100～250ml，一般≤ 300ml。（3）立即用 50～100mmHg 負壓吸引回收灌洗液，通常回收率為40%～60%。（4）將回收液體立即用雙層無菌紗布過濾除去粘液，并記錄總量。（5）裝入硅塑瓶或涂硅滅菌玻璃容器中（減少細胞粘附），置于含有冰塊的保溫瓶中，立即送往實驗室檢查。

現(xiàn)已知BALF成分非常復雜，包含多種細胞（氣道上皮細胞﹑肺泡巨噬細胞﹑中性粒細胞﹑單核細胞等）和大量可溶性成分（脂類﹑核酸﹑蛋白和多肽）［3］。BALF中蛋白種類繁多，其中部分來源于上皮細胞和炎癥細胞分泌產(chǎn)物，另一部分來源于循環(huán)血液。與血液相比，用BALF做蛋白組學分析優(yōu)勢在于其蛋白濃度低，高豐度非特異性蛋白種類少，顯著增加了發(fā)現(xiàn)肺部疾病特異性蛋白的機會。

1.2 主要技術(shù) 目前主要應(yīng)用于BALF蛋白組學分析技術(shù)包括二維凝膠電泳（2-DE）﹑液相色譜（LC）和質(zhì)譜（MS）。在二維凝膠電泳中，蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點和分子量分別在第一維和第二維平面上分離，然后經(jīng)過染色得到二維蛋白圖譜。質(zhì)譜法是將被測物質(zhì)離子化，按質(zhì)荷比分離，經(jīng)放大器形成圖譜從而分析物質(zhì)成分，具有高通量﹑高靈敏度﹑檢測速度快﹑重復性好等優(yōu)點。隨著質(zhì)譜的快速發(fā)展，使其成為蛋白組學的核心技術(shù)。不同類型的質(zhì)譜功能也有所不同，液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜法對小分子量﹑疏水性蛋白的鑒定與定量具有明顯優(yōu)勢，被認為是2-DE的重要替代方法。

2 BALF蛋白組學與肺部疾病

由于不同病理機制都可能導致BALF中某一蛋白含量的增高或降低，因此分析單一蛋白對特定疾病的價值不大。Bell等［4］于1979年首次用BALF做蛋白組學分析，建立了吸煙者與未吸煙者的BALF二維凝膠圖譜。隨后，許多學者［5-7］通過BALF蛋白組學研究了多種肺部疾病如：結(jié)節(jié)病﹑特發(fā)性肺纖維化﹑過敏性肺泡炎﹑慢性阻塞性肺疾病等。研究結(jié)果表明，不同肺部疾病會引起B(yǎng)ALF中大量蛋白的差異表達，這些差異蛋白質(zhì)又參與了不同生物途徑，發(fā)揮不同生物效應(yīng)。因此，鑒定這些蛋白質(zhì)將有助于了解肺部疾病的病理機制，篩選生物標志物以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶標。

3 BALF蛋白組學與肺癌

目前，肺癌蛋白組學主要目的是尋找敏感性高﹑特異性好的生物標志物，從而幫助臨床對肺癌進行早期診斷﹑預后監(jiān)測以及開辟新的治療方法?，F(xiàn)已有很多關(guān)于肺癌蛋白組學的相關(guān)報道，但大部分研究標本集中在組織﹑血液和痰液等，這些標本或多或少存在自身缺陷。組織標本取材創(chuàng)傷較大﹑不易獲取。另外，大多數(shù)肺癌患者早期發(fā)病隱匿，組織標本在早期診斷上具有困難。痰液標本取材簡單﹑無創(chuàng)，但標本質(zhì)量容易受咳痰方式影響。血液標本中蛋白成分復雜，大部分都是高豐度﹑非特異性蛋白，這對研究肺癌相關(guān)蛋白具有嚴重干擾。由于BALF具有微創(chuàng)﹑干擾蛋白少﹑與癌組織相鄰等優(yōu)點，使其能更好地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實踐。近些年來，越來越多的學者開始以BALF為樣本研究肺癌蛋白組學，并取得了很多新的成果。

3.1 診斷性標志物 良好的診斷性標志物必須具有高敏感性和特異性，在疾病的早期即可出現(xiàn)明顯的變化。目前，BALF蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)了許多對肺癌具有診斷價值的標志物，其中上清可溶性蛋白有：丙酮酸激酶M2（PKM2）﹑AKR1B10［8］﹑天冬氨酸蛋白酶A（Napsin A）﹑中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）［9］﹑補體 C4-A（CO4A）﹑結(jié)合珠蛋白（HPT）﹑谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GTSP1）［10-11］﹑TIMP-1﹑載脂蛋白2﹑胱抑素 C［12］等。

Pastor等［8］于2012年首次真正意義上做了有關(guān)肺癌患者BALF蛋白組學的臨床研究。他們用2-DE和基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)檢測出了與肺癌和COPD有關(guān)的40種蛋白，發(fā)現(xiàn)PKM2和AKR1B10在肺癌組中顯著上調(diào)。PKM2是糖酵解的關(guān)鍵酶，能幫助腫瘤細胞在低糖﹑低氧環(huán)境中生存，促進腫瘤的侵襲［13］。AKR1B10能高效催化視黃酸的降解，視磺酸的缺乏與氣道鱗狀上皮化生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，這可能是BALF中AKR1B10高表達導致肺癌的病理機制。Li等［9］提出BALF中糖蛋白最有望成為肺癌診斷標志物，他們用蛋白組學方法發(fā)現(xiàn)8種糖蛋白在肺癌組中顯著升高，其中Napsin A以55ng/mg為臨界值診斷肺腺癌的敏感性和特異性分別為84.21%﹑66.67%。最近，Hmmier等［12］用非標記質(zhì)譜法和ELISA法研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1﹑載脂蛋白2﹑胱抑素C在肺癌患者BALF和血清中均明顯升高，可作為肺癌的診斷指標。TIMP是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）天然抑制劑，MMP存在于正常大多數(shù)組織和體液中，在癌癥中被認為與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)。GTSP1是上述唯一在肺癌組中表達下調(diào)的蛋白，GTSP1是一種主要的解毒酶和應(yīng)激反應(yīng)信號蛋白，是細胞抵御致癌物質(zhì)和化療藥物的重要組成部分。研究表明［14］，GTSP1能負性調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶5（CDK5）活性，而CDK5過度活化與細胞異常增殖和癌癥侵襲有關(guān)，這可能是其在肺癌中表達下調(diào)的原因。

Uribarri等［11］用二維凝膠電泳建立了139個肺癌患者和49個肺部良性病變患者的BALF差異蛋白圖譜，經(jīng)磁珠免疫法驗證分析得出：聯(lián)合檢測載脂蛋白A1（APOA1）﹑CO4A﹑CRP﹑GSTP1和血清淀粉樣p物質(zhì)（SAMP）在診斷肺癌上的敏感性為95%，特異性為81%，SAMP是最好的肺癌診斷標志物，單獨診斷肺癌的敏感性為95%，特異性為66%。此外，在肺癌患者BALF細胞碎片中也發(fā)現(xiàn)了許多與肺癌密切相關(guān)的蛋白，如：S100-A8﹑膜聯(lián)蛋白A1﹑膜聯(lián)蛋白A2﹑胸甘磷酸化酶（TYMP）和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2（TG2）等［15］，表明不管是可溶性蛋白還是細胞分泌蛋白都可作為肺癌標志物進行研究。

3.2 分型標志物 肺癌可分為兩大類：小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞癌（NSCLC），臨床上以NSCLC最為多見。NSCLC中大多數(shù)為腺癌，其次為鱗狀細胞癌﹑大細胞癌及極少數(shù)變異型肺癌。不同類型的肺癌臨床治療﹑療效反映及預后皆不相同。如最近批準了通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）﹑表皮生長因子受體（EGFR）﹑間變性淋巴瘤激酶（ALK）和活性氧物質(zhì)（ROS-1）用來靶向治療非鱗狀細胞癌的NSCLC的幾項方案，因此準確地對肺癌進行分型十分重要［16］。

Uribarri等［11］研究發(fā)現(xiàn)了NSCLC和SCLC患者BALF中幾種差異蛋白：CRP﹑GSTP1﹑SAMP﹑STMN1。其中GSTP1和STMN1在SCLC中表達較高，聯(lián)合檢測兩者鑒別NSCLC和SCLC的敏感度為90%，特異性為57%。STMN1是最重要的鑒別指標，單獨鑒別NSCLC和SCLC的敏感性為90%，特異性為52%。STMN1是一種腫瘤蛋白，參與微管動力學，研究表明其在小細胞肺癌相關(guān)細胞的細胞膜中過表達，與肺癌分化不良有關(guān)，有可能作為抗癌治療靶點［17］。Hmmier等［12］也發(fā)現(xiàn)了BALF中肺腺癌與肺鱗癌之間的許多差異蛋白，其中中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）在鱗癌中的含量是腺癌的11.8倍，葉酸受體α在腺癌中的含量是鱗癌的14倍，這與用免疫組化技術(shù)分析肺癌組織的結(jié)果相同［18-19］，表明其可能作為肺癌分型的重要標志物。

4 展望

肺癌的高發(fā)病率和病死率一直是困擾我們的難題，蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔者，如果能找出肺癌特異相關(guān)的蛋白將為攻克肺癌這一難題帶來希望。BALF以其獨特的優(yōu)勢被越來越多的學者選作研究肺部相關(guān)疾病的樣本，蛋白組學能檢測出BALF中與肺癌相關(guān)的更敏感的生物指標，從而有助于肺癌的早期診斷﹑預后監(jiān)測及分型。不過，目前肺癌BALF蛋白組學方面還有不少問題有待解決，比如樣本的收集﹑處理以及檢測方法還存在標準化的問題，這些都是影響檢測結(jié)果的重要因素，其中最重要的是可重復性檢測。只有先解決這些問題，BALF蛋白組學的研究成果才能真正應(yīng)用于臨床。另外，BALF中蛋白含量的動態(tài)范圍約有1010，然而質(zhì)譜只能檢測出102～104種蛋白，對于低豐度﹑低分子量的蛋白檢測依然存在難度。肺癌BALF蛋白組學的研究起步較晚，文獻報道的樣本量存在不足，研究方法較單一，檢測出的相關(guān)蛋白分子還需要更多研究去驗證。但是，目前研究顯示肺癌BALF蛋白組學具有良好的前景［20］，隨著蛋白組學相關(guān)技術(shù)和研究方法更加完善，期待將來能檢測出更多的敏感性高﹑特異性好的肺癌生物標志物，使我們能從分子水平全面了解肺癌發(fā)病機理，從而能夠?qū)Ψ伟┗颊邷蚀_地做出早期診斷﹑分型﹑評估預后以及開辟新的有效治療方法。

［1］ Lortet-Tieulent J,Soerjomataram I,Ferlay J,et al．International trends in lung cancer incidence by histological subtype: adenocarcinoma stabilizing in men but still increasing in women．Lung Cancer,2014,84(1):13-22．

［2］ Esendagli G,Bruderek K,Goldmann T,et al．Malignant and nonmalignant lung tissue areas are differentially populated by natural killer cells and regulatory T cells in non-small cell lung cancer．Lung Cancer,2008,59(1):32-40．

［3］ Noel-Georis I,Bernard A,Falmagne P,et al．Database of bronchoalveolar lavage fluid proteins．J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2002,771(1-2):221-236．

［4］ Bell DY,Hook GE．Pulmonary alveolar proteinosis: analysis of airway and alveolar proteins．Am Rev Respir Dis,1979,119(6):979-990．

［5］ Foster MW,Morrison LD,Todd JL,et al．Quantitative proteomics of bronchoalveolar lavage fluid in idiopathic pulmonary fibrosis．J Proteome Res,2015,14(2):1238-1249．

［6］ Okamoto T,Miyazaki Y,Shirahama R,et al．Proteome analysis of bronchoalveolar lavage fluid in chronic hypersensitivity pneumonitis．Allergol Int,2012,61(1):83-92．

［7］ Plymoth A,Lofdahl CG,Ekberg-Jansson A,et al．Protein expression patterns associated with progression of chronic obstructive pulmonary disease in bronchoalveolar lavage of smokers．Clin Chem, 2007,53(4):636-644．

［8］ Pastor MD,Nogal A,Molina-Pinelo S,et al．Identification of proteomic signatures associated with lung cancer and COPD．Journal of Proteomics,2013,89:227-237．

［9］ Li Q K,Shah P,Li Y,et al．Glycoproteomic Analysis of Bronchoalveolar Lavage(BAL)Fluid Identifies Tumor-Associated Glycoproteins from Lung Adenocarcinonna．Journal Of Proteome Research,2013,12(8):3689-3696．

［10］ Ortea I,Rodriguez-Ariza A,Chicano-Galvez E,et al．Discovery of potential protein biomarkers of lung adenocarcinoma in bronchoalveolar lavage fluid by SWATH MS data-independent acquisition and targeted data extraction．J Proteomics, 2016, 138:106-114．

［11］ Uribarri M,Hormaeche I,Zalacain R,et al．A new biomarker panel in bronchoalveolar lavage for an improved lung cancer diagnosis．J Thorac Oncol,2014,9(10):1504-1512．

［12］ Hmmier A,O'Brien M E,Lynch V,et al．Proteomic analysis of bronchoalveolar lavage fluid(BALF)from lung cancer patients using label-free mass spectrometry．BBA Clin,2017,7:97-104．

［13］ Ruiz F X,Gallego O,Ardevol A,et al．Aldo-keto reductases from the AKR1B subfamily: retinoid specificity and control of cellular retinoic acid levels．Chem Biol Interact,2009,178(1-3):171-177．

［14］ Sun KH,Chang KH,Clawson S,et al．Glutathione-S-transferase P1 is a critical regulator of Cdk5 kinase activity．J Neurochem,2011, 118(5):902-914．

［15］ Almatroodi SA,McDonald CF,Collins AL,et al．Quantitative proteomics of bronchoalveolar lavage fluid in lung adenocarcinoma．Cancer Genomics Proteomics,2015,12(1):39-48．

［16］ Bansal P,Osman D,Gan GN,et al．Recent Advances in Targetable Therapeutics in Metastatic Non-Squamous NSCLC．Front Oncol, 2016,6:112．

［17］ Ocak S,Friedman DB,Chen H,et al．Discovery of new membraneassociated proteins overexpressed in small-cell lung cancer．J Thorac Oncol,2014,9(3):324-336．

［18］ Nunez MI,Behrens C,Woods DM,et al．High expression of folate receptor alpha in lung cancer correlates with adenocarcinoma histology and EGFR mutation．Laboratory investigation, 2011,911: 420A-421A．

［19］ O'Shannessy DJ,Yu G,Smale R,et al．Folate receptor alpha expression in lung cancer: diagnostic and prognostic significance．Oncotarget, 2012,3(4):414-425．

［20］ Carvalho AS,Cuco CM,Lavareda C,et al．Bronchoalveolar Lavage Proteomics in Patients with Suspected Lung Cancer．Sci Rep,2017,7:42190．