研究背景

炎癥的主要有五大表現(xiàn)：紅、腫、熱、痛和功能喪失。作為炎癥最主要的特征，疼痛通過(guò)向大腦發(fā)出警告（傷害性）信號(hào)并觸發(fā)逃避反應(yīng)來(lái)保護(hù)炎性組織。與此同時(shí)，外周神經(jīng)系統(tǒng)中的傷害性感受器也同步激活，通過(guò)產(chǎn)生神經(jīng)肽（如P物質(zhì)）和趨化因子（如CCL2）等引起神經(jīng)源性炎癥和神經(jīng)炎癥。組織損傷后的炎癥會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞的募集并且進(jìn)入受損部位。根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)的不同，不同的細(xì)胞進(jìn)入受損組織的速度也不同：中性粒細(xì)胞可以在在幾小時(shí)內(nèi)進(jìn)入受損的組織，而巨噬細(xì)胞往往需要幾天。這些免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，如促炎細(xì)胞因子 (TNF-α，IL-1β)，通過(guò)與皮膚、肌肉和關(guān)節(jié)組織傷害感受器上的細(xì)胞因子受體結(jié)合而引起炎癥性疼痛。可控的炎癥具有生理性保護(hù)功能，適度炎癥是為了消除細(xì)胞損傷的最初誘因，促進(jìn)組織修復(fù)進(jìn)而恢復(fù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。急性炎癥的消退是一個(gè)活躍的過(guò)程包括SPMs(specialized proresolving mediators) 的產(chǎn)生。SPM相比較于嗎啡，可以以更低劑量顯著抑制炎性痛。值得一提的是，由DHA合成的PD1 (protectin D1) 和NPD1(neuroprotectin D1) 可以通過(guò)對(duì)神經(jīng)元、免疫細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的多重作用，有效抑制炎癥反應(yīng)和炎性痛。

研究證明SPMs可以通過(guò)促進(jìn)吞噬清除炎癥反應(yīng)的病原體和細(xì)胞碎片以消退炎癥。在哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中，吞噬反應(yīng)是由免疫細(xì)胞與PAMPs (pathogen-associated molecular patterns)的接觸所激活，如酵母聚糖。巨噬細(xì)胞在吞噬中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并且表現(xiàn)出不同的亞型，如促炎的M1型和抑炎的M2型。但是，巨噬細(xì)胞吞噬和表型改變的信號(hào)通路和分子機(jī)制仍未完全闡明。

GPR37是一種parkin蛋白的底物，高表達(dá)于腦，并與腦神經(jīng)紊亂性疾病如帕金森病和孤獨(dú)癥等密切相關(guān)。GPR37還可與多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合參與調(diào)節(jié)多巴胺的攝取。也有研究表明GPR37基因突變與孤獨(dú)癥譜系障礙密切相關(guān)。然而，GPR37在免疫細(xì)胞的作用仍未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)GPR37表達(dá)于巨噬細(xì)胞而不是小膠質(zhì)細(xì)胞，并且證明GPR37是NPD1的潛在受體，在NPD1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子信號(hào)和吞噬中發(fā)揮必不可少的作用。GPR37基因缺失的巨噬細(xì)胞中NPD1的功能被取消。因此，本研究得出結(jié)論：GPR37在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥痛的消退中至關(guān)重要。

主要研究結(jié)果

作者首先利用免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)了GRP37的組織與細(xì)胞分布情況。IHC結(jié)果顯示，GPR37定位于小鼠后足皮膚的真皮層，雙標(biāo)染色結(jié)果顯示GPR37主要與巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68共標(biāo)，而與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CX3CR1沒(méi)有共標(biāo)，LacZ染色也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá)GPR37的細(xì)胞核與IBA-1（小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物）共標(biāo)。因此GPR37表達(dá)于巨噬細(xì)胞，而不是小膠質(zhì)細(xì)胞。

作者接下來(lái)考察了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變是否與GRP37有關(guān)。首先作者構(gòu)建了GPR37的表達(dá)載體并且轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞上，接下來(lái)對(duì)過(guò)表達(dá)GPR37的HEK293細(xì)胞進(jìn)行鈣成像，發(fā)現(xiàn)TX14和NPD1均可以顯著增加iCa2+。而在巨噬細(xì)胞中NPD1誘導(dǎo)的iCa2+增加在GPR37基因缺失的巨噬細(xì)胞中被取消。以上數(shù)據(jù)可以證明NPD1通過(guò)GPR37誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和HEK293細(xì)胞iCa2+增加。

作者接下來(lái)考察了GPR37對(duì)于巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。作者采用了熒光標(biāo)記的酵母聚糖顆粒吞噬法檢測(cè)了巨噬細(xì)胞的吞噬活性。結(jié)果顯示NPD1可以劑量依賴性的增加吞噬活性，并且在GPR37基因缺失的巨噬細(xì)胞中被取消。進(jìn)一步研究證明NPD1誘導(dǎo)的吞噬可以被鈣離子螯合劑、PTX、ERK信號(hào)通路抑制劑和PI3K/AKT抑制劑所抑制。所以，NPD1可能是通過(guò)GPR37，iCa2+，PI3K/AKT和ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬。

在離體水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一定在整體動(dòng)物水平中可以被重現(xiàn)出來(lái)，因此作者進(jìn)一步采用了小鼠模型來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證GPR37對(duì)于巨噬細(xì)胞吞噬功能以及炎癥消退的結(jié)果。在小鼠后足足底注射熒光標(biāo)記的酵母聚糖顆粒制備炎癥痛模型，觀察水腫時(shí)間，免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）的浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞吞噬酵母聚糖的情況。水腫發(fā)生于2 h，4 h達(dá)峰，之后稍有降低并持續(xù)1天，第8天完全恢復(fù)。IHC結(jié)果顯示免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，最早發(fā)生浸潤(rùn)的是中性粒細(xì)胞，之后是巨噬細(xì)胞。雙重免疫染色結(jié)果顯示吞噬的酵母聚糖主要定位于表達(dá)GPR37的巨噬細(xì)胞，Gpr37-KO小鼠中吞噬的酵母聚糖水平顯著降低。

酵母多糖增加WT小鼠炎性皮膚Il1b mRNA水平和IL-1β蛋白水平，但是在Gpr37-KO小鼠中增加程度更高。同時(shí)，酵母多糖可以從mRNA和蛋白水平增加WT小鼠炎性皮膚抗炎因子IL-10和TGF-β水平，但在Gpr37-KO小鼠中作用被取消。GPR37通過(guò)抑制酵母多糖激活的巨噬細(xì)胞促炎因子(IL-1β)的表達(dá)和促進(jìn)抗炎因子 (IL-10，TGF-β)的表達(dá)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型。

通過(guò)足底注射聯(lián)合應(yīng)用WT 巨噬細(xì)胞和IL-10的抗體阻斷巨噬細(xì)胞的IL-10。發(fā)現(xiàn)WT 巨噬細(xì)胞移植到GPR37缺陷小鼠中可促進(jìn)炎性疼痛的消退。這一結(jié)果表明，WT 巨噬細(xì)胞可能通過(guò)IL-10分泌參與炎癥痛的消退。

討 論

本研究首次揭示了GPR37表達(dá)于巨噬細(xì)胞，而不是小膠質(zhì)細(xì)胞。GPR37作為NPD1的潛在受體，在NPD1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。GPR37分子是NPD 1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和吞噬所必需的。NPD 1的這些作用在GPR 37缺乏的巨噬細(xì)胞中被取消。本研究發(fā)現(xiàn)GPR37另一個(gè)重要作用是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型。表達(dá)GPR37的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更多的M2型而不是M1型，產(chǎn)生低水平的IL-1β和高水平的IL-10和TGF-β，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的消退。因此，藥理學(xué)上增強(qiáng)吞噬能力和巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化在治療慢性炎癥性疾病和慢性疼痛上有巨大潛力。

炎癥的主動(dòng)消退已成為一種新型的炎癥痛治療策略。以往研究的轉(zhuǎn)化落腳點(diǎn)不足。而本研究不僅為炎癥的消退提供了一個(gè)在巨噬細(xì)胞上而不僅僅是小膠質(zhì)細(xì)胞上的靶分子-GPR37，并且還證明GPR37對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疼痛的解決至關(guān)重要；還進(jìn)一步找到了調(diào)節(jié)GPR37分子的藥物先導(dǎo)化合物，一個(gè)來(lái)自于魚(yú)油的衍生物NPD1。 用NPD1或其他仿制藥或GPR37的小分子激動(dòng)劑特異性靶向巨噬細(xì)胞GPR37，很可能成為治療炎癥痛和其他炎癥相關(guān)疾病的關(guān)鍵手段。

利用巨噬細(xì)胞而不是殺傷巨噬細(xì)胞來(lái)“退炎鎮(zhèn)痛”在未來(lái)可能成為新的鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)策略。