孫瑋璐，韓翰

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)2015級12班，遼寧 沈陽 110034；2.基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室）

SAHA-CTSB對三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的誘導作用

孫瑋璐1，韓翰2*

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)2015級12班，遼寧 沈陽 110034；2.基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室）

目的：探討辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）是否經由組織蛋白酶B（CTSB）的有效調控誘導人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞凋亡的發(fā)生。方法：采用Western blot及ELISA法檢測SAHA、CTSB抑制劑（Cystain C）對乳腺癌細胞中CTSB表達的影響；采用Muse自動分析儀檢測SAHA、Cystain C對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力及凋亡的影響。結果：Cystatin C對乳腺癌細胞中CTSB的有效抑制濃度為100 ng/ml；Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌細胞后，乳腺癌細胞活力及凋亡細胞比率較單獨SAHA處理組相比恢復明顯，差異均有統(tǒng)計學意義。結論：SAHA對乳腺癌的生長抑制作用需要CTSB的參與。

活乳腺癌；SAHA；CTSB；凋亡

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤［1-2］。據統(tǒng)計，在過去的20年中，全球乳腺癌絕對數量上升了1.4倍，我國每年新發(fā)女性乳腺癌病例約27.9萬，位居女性發(fā)病首位，且三陰乳腺癌發(fā)病比例越來越大［3-4］。目前，乳腺癌的治療仍以手術為主，輔助放療和化療，雖然有一定的療效，但仍存在嚴重的不良反應和普遍的耐藥現(xiàn)象［5-6］。

組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACi）作為抗腫瘤藥物為探索女性惡性腫瘤治療提供了新方向［7-9］。辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）是目前已知最經典的HDACi之一，研究表明，SAHA對乳腺癌、神經膠質瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、卵巢癌等均有高效殺傷作用，并且不良反應較少［10-12］。

組織蛋白酶B（Cathepsin B，CTSB）是溶酶體內半胱氨酸組織蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶家族，其廣泛地參與蛋白質的降解，并在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［13-14］，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其與細胞凋亡有著密切的聯(lián)系［15-16］。

研究表明，SAHA可通過影響乳腺癌細胞周期來抑制細胞增殖［17-19］，但其全部作用靶點并沒有闡明，因此，有針對性地篩選出SAHA作用的新效應靶點是十分必要的。本文選取三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231，探討SAHA是否經由CTSB的有效調控，啟動細胞凋亡反應，從而抑制乳腺癌細胞的生長增殖。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自美國ATCC細胞庫；Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購自美國Thermo公司；SAHA、CTSB抑制劑（Cystain C）購自美國Sigma-Aldrich 公司；Muse Annexin V&Dead Cell、Muse Count&Viability試劑盒購自德國Merck Millipore公司；Human Pro-Cathepsin B ELISA試劑盒購自美國R&D公司；其他的化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含15%胎牛血清的Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基（含100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素），37℃、5%CO2的條件下傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot法檢測SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞中CTSB的影響 將5×105個/ml的MDAMB-231細胞接種于6孔板各孔內，待細胞鋪滿率＞75%進行L-15無血清同步化處理后，加入5 μmol/L的SAHA與不同濃度的CTSB抑制劑Cystain C（0、20、40、60、80、100 ng/ml）共同培養(yǎng)48 h，收集細胞后，采用RIPA蛋白裂解液提取出的蛋白應用BCA蛋白分析試劑盒測定，調整蛋白濃度。蛋白煮沸變性后，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉移至PVDF膜上。封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜。TBST沖洗10 min，3次，將膜放入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗中，室溫中搖床振蕩60 min，用TBST洗膜10 min，3次，將等體積混合的ECL化學發(fā)光底物A、B液均勻加在PVDF膜上，顯色5 min。化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光后，計算膜上各抗體標記點的灰度值。

1.2.3 ELISA檢測SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞中CTSB表達量的影響 將5×105個/ml的MDAMB-231細胞接種于6孔板各孔內，待細胞鋪滿率＞75%進行L-15無血清同步化處理后，加入5 μmol/L的SAHA與不同濃度的CTSB抑制劑Cystain C（0、20、40、60、80、100 ng/ml）共同培養(yǎng)48 h，加入裂解液進行裂解后，經酶標抗體孵育、底物顯色處理，在450 nm處用酶標儀測定SAHA和Cystain C各處理組對MDA-MB-231細胞中CTSB蛋白表達的影響。

1.2.4 細胞活力檢測 將5×105個/ml乳腺癌MDAMB-231細胞分別接種于6孔板各孔中，待細胞鋪滿率＞75%進行無血清同步化處理。MDA-MB-231細胞加入5 μmol/L SAHA和100 ng/ml Cystain C共同孵育。取2×105個乳腺癌MDA-MB-231細胞和450 μl Count&Viability試劑共同孵育5 min。通過Muse自動細胞分析儀（德國MerckMillipore公司）Cell Count&Viability software module分析各處理因素誘導MDA-MB-231細胞活力發(fā)生的情況。1.2.5 細胞凋亡檢測 將5×105個/ml乳腺癌MDAMB-231細胞分別接種于6孔板各孔中，待細胞鋪滿率＞75%進行無血清同步化處理。MDA-MB-231細胞加入5 μmol/L SAHA和100 ng/ml Cystain C共同孵育。取2×105個乳腺癌MDA-MB-231細胞和100 μl Muse Annexin V＆Dead Cell試劑室溫孵育20 min。應用自動細胞分析儀Muse Cell Analyzer檢測各處理因素誘導MDA-MB-231細胞凋亡發(fā)生的情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以均值±標準差表示，多組數據比較采用單因素方差分析，2組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞中CTSB的影響 Western blot檢測結果顯示：與空白對照組相比，SAHA能夠顯著增加乳腺癌細胞中CTSB的蛋白含量，當加入CTSB特異性抑制劑Cystain C后，發(fā)現(xiàn)Cystain C對SAHA引起的CTSB表達升高具有不同抑制作用，僅Cystain C濃度達到100 ng/ml抑制作用達到最強，與SAHA+0 ng/ml Cystatin C組比較，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1。

圖1 Western blot檢測SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞MDA-MB-231中CTSB表達的影響

ELISA結果也驗證了上述實驗結果，與空白對照組相比，SAHA可顯著升高乳腺癌MDA-MB-231細胞中CTSB的相對表達量。低濃度的Cystatin C不能有效地抑制SAHA引起的CTSB相對表達量的升高，只有濃度達到100 ng/ml時，CTSB的相對表達量才有所下降，且與SAHA+0 ng/ml Cystatin C組比較，差異有統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖2 ELISA檢測SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞MDAMB-231中CTSB表達的影響

2.2 SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞活力的影響 為明確CTSB在SAHA抑制乳腺癌細胞生長過程中的作用，將100 ng/ml Cystain C作用于MDAMB-231細胞中以抑制CTSB的表達，分析SAHA對乳腺癌細胞活力的影響。結果發(fā)現(xiàn)，單獨SAHA能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖，活細胞比率下降（P＜0.05）；單獨Cystain C對乳腺癌細胞影響不大，細胞活力無明顯的變化；而Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌細胞后，乳腺癌細胞活力較單獨SAHA處理組相比恢復明顯，MDA-MB-231活細胞比率高于單獨SAHA處理組（P＜0.05），見圖3。

圖3 Muse自動細胞分析儀分析SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞活力的影響（*P＜0.05）

2.3 SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞凋亡的影響 細胞凋亡結果顯示：單獨SAHA能夠顯著誘導乳腺癌細胞的凋亡，凋亡細胞（含早、晚期凋亡）和死細胞比率升高（P＜0.05）；單獨Cystain C作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞后凋亡細胞（含早、晚期凋亡）和死細胞比率與空白對照組相比相差不大；而Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌細胞后，乳腺癌MDA-MB-231凋亡細胞（含早、晚期凋亡）和死細胞比率較SAHA組下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 Muse自動細胞細胞儀分析SAHA、Cystain C對乳腺癌細胞凋亡的影響（*P＜0.05）

3 討論

細胞凋亡是一個高度程序化的主動過程，由一系列相關基因進行調控［20］。在機體發(fā)育過程中，細胞凋亡在組織和器官的構建中起著重要的作用，是通過啟動細胞自身的內部死亡機制而產生的一種細胞死亡方式，誘導腫瘤細胞凋亡是許多抗腫瘤藥物的作用機制之一［21］。

前期研究確定了5 μmol/L SAHA作用三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞48 h后可明顯抑制乳腺癌細胞的生長［11］，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L的SAHA可導致乳腺癌細胞活力下降，誘導乳腺癌細胞凋亡。Western blot和ELISA等實驗結果顯示，SAHA作用乳腺癌細胞過程中伴隨著CTSB蛋白表達量的增高。CTSB可以調節(jié)細胞凋亡，調節(jié)其他蛋白酶的表達，與細胞凋亡存在密切關系［15-16］。SAHA是否通過調控細胞中CTSB的表達從而誘導細胞凋亡的產生目前還無法確定。我們利用CTSB特異性抑制劑Cystain C阻斷乳腺癌MDAMB-231細胞中CTSB的表達，檢測CTSB在SAHA抑制乳腺癌細胞生長中的調控作用。

本研究Western blot實驗結果顯示，當Cystatin C濃度達到100 ng/ml時，能夠顯著抑制SAHA引起的乳腺癌細胞中CTSB的升高，ELISA證實了上述實驗結果。接下來，我們將篩選出的Cystain C、SAHA作用于MDA-MB-231細胞中，分別分析了乳腺癌細胞活力和細胞凋亡的變化情況。發(fā)現(xiàn)當利用Cystain C抑制乳腺癌細胞中CTSB的表達時，對乳腺癌細胞影響不大，細胞活力及凋亡無明顯的變化，說明CTSB功能失活對乳腺癌細胞的生長增殖沒有明顯調控作用，同時也表明Cystain C不會產生細胞毒性，可以作為本實驗中獨立因素抑制MDA-MB-231細胞中CTSB的表達；而單獨SAHA處理顯著抑制了乳腺癌細胞的生長，表現(xiàn)為細胞活力下降，細胞凋亡細胞（含早、晚期凋亡）和死細胞比率明顯上升；用Cystain C抑制CTSB的表達后，SAHA處理的乳腺癌MDA-MB-231細胞的活細胞比率較SAHA單獨處理組升高，而凋亡細胞（含早、晚期凋亡）和死細胞比率較SAHA單獨處理組降低。實驗結果表明抑制細胞中CTSB的表達能夠明顯阻抑SAHA對乳腺癌細胞的生長抑制效應，因此，SAHA對乳腺癌細胞的凋亡誘導作用需要CTSB的調控。

綜上所述，SAHA的抗腫瘤作用雖已被證實，但其全部作用靶點并未完全闡明。而本研究初步闡明了SAHA經CTSB介導產生細胞凋亡，從而抑制了乳腺癌細胞的生長增殖。

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SAHA Induces Apoptosis in Triple-negative Breast Cancer Cell MDA-MB-231 via the Regulation of CathepsinB

SUN Weilu1，HAN Han2*
（1.Class 12 Grade 2015，Shenyang Medical College Shenyang 110034，China；2.Department of Biochemistry）

Objective：To clarify the regulation role of cathepsin B （CTSB） in cell apoptosis induced by SAHA in triplenegative breast cancer cell MDA-MB-231.Methods：MDA-MB-231 cells were incubated with SAHA and/or Cystain C，the expression of CTSB was determined by Western blot and ELISA，the cell viability and apoptosis of MDA-MB-231 cells were detected by Muse cell analyzer.Results：The optimal concentration of Cystain C was 100 ng/ml.The cell viability and apoptosis test demonstrated that the combination treatment of Cystatin C and SAHA significantly resumed the inhibitory effect caused by SAHA alone.Conclusion：CTSB plays an important role in apoptosis induced by SAHA in triple-negative breast cancer cell MDA-MB-231.

breast cancer；SAHA；CTSB；apoptosis

R725

A

1008-2344（2017）06-0530-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.021

沈陽醫(yī)學院科研基金項目（No.20141004）；沈陽醫(yī)學院大學生科研課題（No.20179002）

韓翰（1982—），女（漢），講師，研究方向：腫瘤分子機制研究.E-mail：hanhan82831@163.com

2017-07-07

（文敏編輯）