胡曉苗 ， 張丹俊 ， 戴 銀 ， 趙瑞宏 ， 潘孝成 ， 周學(xué)利 ， 侯宏艷 ， 沈?qū)W懷 ， 朱傳明

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 安徽 合肥 230031)

在我國，H9N2亞型禽流感病毒疫苗大部分還在使用,一些早期的分離株，例如華南地區(qū)使用的Ck/GD/SS/1994疫苗株，山東地區(qū)使用的Ck/SD/6/96疫苗株以及華東地區(qū)使用的SH/F/98疫苗株。疫苗的大規(guī)模使用對禽流感的防控確實發(fā)揮了重要作用，然而疫苗免疫壓力的存在卻加速了AIV的變異[1-4]。安徽地區(qū)近些年間H9N2亞型禽流感的監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，當(dāng)前流行的H9N2病毒在遺傳進化和抗原性分析方面均發(fā)生了比較顯著的變化，其中HA基因遺傳進化分支已演變?yōu)橐訷280亞系占絕對優(yōu)勢。此外，HA蛋白一些關(guān)鍵位點氨基酸殘基、糖基化位點、受體結(jié)合位點也均有不同程度的突變，現(xiàn)有疫苗株的保護效果亟需進一步評價[5-6]。這提示我們，應(yīng)該盡快篩選新的H9N2疫苗株用于研制新型疫苗，以應(yīng)對已出現(xiàn)變異的H9N2亞型禽流感的防控。

1 材料與方法

1.1 試劑 禽流感抗H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及抗原，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 毒株 經(jīng)過HA基因遺傳進化分析，選取12株近年來流行的H9亞型AIV，Dk/HK/Y280/97-like病毒亞系高度同源[5-6]，均為本實驗室分離鑒定、保存。

1.3 實驗動物和雞胚 SPF種蛋，購自山東省家禽研究所SPF種雞場，在本實驗室孵化至9-11日齡雞胚使用；SPF雞由上述雞胚繼續(xù)孵化至出雛，飼養(yǎng)于實驗室動物房中至10日齡。

1.4 病毒增殖能力的測定 按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄對近3年分離的12株H9亞型AIV接種雞胚后收集的尿囊液的病毒含量進行測定。將尿囊液作10倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-93個稀釋度，尿囊腔內(nèi)接種于10日齡SPF雞胚，測定各雞胚尿囊液的凝集效價。根據(jù)尿囊液HA測定結(jié)果按Reed-Muench法計算雞胚半數(shù)感染量(EID50)[7]。

1.5 病毒的純化 選擇HA效價較高(HA>29)的4株病毒，分別進行5輪有限稀釋純化(10-5-10-9)，將純化好的上述病毒尿囊液分別按10-5稀釋后，接種9～11日齡SPF雞胚(0.2 mL)15枚，置37 ℃孵化72 h，去除死亡胚，所有活胚4 ℃放置5 h。收集72 h后活胚的尿囊液，取血凝價大于9 log2的雞胚尿囊液，分裝成小份，置-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫血清的制備 將純化好的尿囊液按常規(guī)方法制備油乳劑滅活疫苗[8]，頸部皮下接種6周齡SPF雞，每次免疫0.3 mL/只，于首免后2周加強免疫1次，0.5 mL/只，于二免后21 d采血，分離血清，分別保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 交叉HI試驗 用制備的免疫血清與近年來流行代表毒株進行交叉HI試驗[9-10]，根據(jù)結(jié)果將篩選出的最優(yōu)秀毒株按常規(guī)方法制備油乳劑滅活疫苗。

1.8 免疫攻毒保護試驗 14日齡SPF雞120只，分成三組，其中兩組各40只分別經(jīng)頸背側(cè)皮下注射商品化F/98疫苗和候選株滅活疫苗，另一組40只為對照組。21 d采血后，若HI效價穩(wěn)定，且在8以上，各試驗組40只雞用選定4個流行毒株(CK/AH/35/15，CK/AH/416/15、CK/AH/36/14、CK/AH/AJ3/15各1株)攻毒，每個毒株攻5只，滴鼻點眼，每只攻毒量約為2×106EID50。觀察攻毒后雞群健康狀況，并于攻毒后第5天采集所有試驗雞的泄殖腔及咽拭子進行病毒分離。每個棉拭樣品處理后接種10日齡SPF雞胚2枚，每24 h照胚1次，觀察120 h后，所有接種的雞胚均進行雞胚尿囊液HA效價測定。對病毒感染為陰性的雞胚，盲傳1代，再次測定HA效價。分析不同毒株滅活疫苗對不同毒株攻擊的交叉保護情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒增殖能力的測定 病毒HA效價檢測結(jié)果顯示，12株病毒的血凝效價從27-11不等。EID50的檢測結(jié)果顯示，12株病毒的EID50為108.00-109.00/100 μL，見表1。

表1 H9N2亞型AIV分離株HA和EID50測定

2.2 病毒純化結(jié)果 選擇HA效價較高的4株病毒倍比稀釋成10-5-10-9的稀釋度，每個稀釋度接種5枚SPF雞胚，0.1 mL/枚，置35 ℃孵箱孵化96 h，棄去24 h內(nèi)的死胚。然后分別收集尿囊液，測定其血凝價，取有血凝價的最高稀釋度的雞胚尿囊液繼續(xù)做下一輪稀釋純化，連續(xù)純化3輪，記錄每一代純化后的EID50，表2可知，純化后的毒株EID50相差不大，證明原始病毒是比較純的，達到預(yù)期效果。

表2 H9N2 AIVs分離株EID50的測定結(jié)果

2.3 交叉HI試驗結(jié)果 以4株毒株免疫SPF雞后分離的血清與這4株毒株、F98株一起進行交叉血凝抑制試驗。結(jié)果顯示，CK/AH/AJ3/15毒株免疫后產(chǎn)生的抗體與5種檢測抗原反應(yīng)的血凝抑制價均值在9.70-10.60之間，而其他3株毒株免疫SPF雞后，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體不管是針對自身抗原還是其他抗原，平均抗體水平分布在7.10-9.70之間。說明CK/AH/AJ3/15株病毒具有很好的免疫原性，可作為疫苗候選株。

表3 H9N2亞型AIV分離株的交叉HI抗體效價測定

2.4 免疫攻毒保護試驗 分別免疫CK/AH/AJ3/15毒株滅活苗和商品化F/98疫苗試驗雞各一組，第三組做對照，在抗體效價達到8 log2后，以106EID50的劑量經(jīng)靜脈注射進行4種毒株和F98株攻毒。從攻毒后的第2天開始，攻毒對照組的雞出現(xiàn)了不同程度的發(fā)病癥狀，發(fā)病的程度從輕度的精神沉郁到羽毛凌亂不等，免疫組雞在攻毒后整體精神狀態(tài)良好。

攻毒后第5天采集所有雞的泄殖腔和氣管棉拭接種10日齡SPF胚，測定排毒情況，結(jié)果見表4。對照組除攻CK/AH/35/15毒株的小組有1只雞泄殖腔不排毒，其余全部排毒，對照組結(jié)果有效。免疫候選株CK/AH/AJ3/15油苗組對4種病毒有很好的保護效果，除了攻CK/AH/416/15病毒的小組有1只雞的泄殖腔排毒，氣管不排毒，其他小組雞都不排毒，總的保護率為97.5%。而免疫F/98疫苗除了攻CK/AH/36/14病毒小組雞泄殖腔、氣管都不

表4 交叉免疫攻毒保護結(jié)果

C:泄殖腔cloaca ; T:氣管trachea

排毒外，攻其他病毒的小組都有雞只排毒，F(xiàn)/98疫苗總的保護率為85%?？梢院苊黠@的看出，候選疫苗株比商品化F/98疫苗保護效果更好。

3 討論

3.1 禽流感病毒具有頻繁變異的特點，包括H9N2亞型病毒也不列外。變異頻繁，當(dāng)前流行的H9N2病毒在抗原性上發(fā)生了較大變化。而養(yǎng)殖生產(chǎn)上使用的H9N2疫苗Ck/SH/F/98等疫苗株至今已有10多年的歷史，免疫保護效果不如從前，已不能滿足養(yǎng)殖生產(chǎn)的需要。在這一背景下，開展禽流感H9N2亞型新疫苗的研制正當(dāng)其時。本試驗在對近年來流行的H9N2病毒遺傳進化分析的基礎(chǔ)上，通過對12株分離的H9N2禽流感病毒的免疫原性和部分生物學(xué)特性的測定，初步認為CK/AH/AJ3/15病毒株可以作為新型H9N2禽流感亞型疫苗研制候選株。

3.2 禽流感病毒是分節(jié)段的負鏈單股RNA病毒,在復(fù)制過程中很容易發(fā)生基因突變及基因重組, 因而決定了其易變的特點，這也是禽流感疫苗免疫保護率跟不上病毒變異的主要原因。疫苗的基因同源性和抗原性差異是影響疫苗免疫效果的關(guān)鍵因素。姜北宇[11]研究發(fā)現(xiàn)，4種不同毒株滅活疫苗的抗原液的HA價差異很大, 最高為9 log2, 最低為5 log2,但其病毒含量(EID50)基本相同,制備出的4種滅活疫苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的HI抗體效價也基本相同。這些觀點提示我們，必須從病毒滴度、抗原性和交叉免疫保護作用等方面篩選疫苗候選株。

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