周孝瓊 ， 陳洪博 ， 潘燦陽(yáng) ， 張 燕 ， 吳蘭芳 ， 王 華

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 ， 福建 龍巖 364012 ; 2.福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 福建 龍巖 364012)

葎草(Humulusscandens)，又名苦瓜藤、鋸鋸藤、拉拉秧、五爪龍、大葉龍五爪蛇干藤，為桑科葎草屬多年生蔓生性植物。該草喜陰耐寒、耐旱，我國(guó)各地均有生長(zhǎng)，常生于荒地、廢墟、林緣、溝邊等地。具有清熱解毒，利尿消腫之功效?？捎糜诜谓Y(jié)核潮熱，感冒發(fā)熱，消化系統(tǒng)炎癥及腹瀉，小便不利，腎盂腎炎，急性腎炎，膀胱炎，泌尿系統(tǒng)結(jié)石；外用可治癰癤腫毒，濕疹，毒蛇咬傷等[1]。葎草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，含有蛋白質(zhì)，礦物質(zhì)、微量元素、維生素、氨基酸等，具有平衡動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，加速動(dòng)物生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)生理機(jī)能等作用，且含大量生物活性物質(zhì)，如多糖、黃酮類(lèi)化合物、生物堿類(lèi)，具有天然藥物功能，能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高抗病力，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力。葎草乙醇提取物具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、消除自由基、抗微生物、促進(jìn)消化、增強(qiáng)免疫等功能[2]。葎草因其生命力強(qiáng)大危害農(nóng)作物的生長(zhǎng)而被稱(chēng)為惡性雜草，至今未作系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)利用，造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。在動(dòng)物生產(chǎn)中用作飼料原料和飼料添加劑，既可緩解飼料原料緊張的問(wèn)題，又可利用葎草的藥用價(jià)值，減少抗生素的濫用，提高食品安全性，以滿(mǎn)足人們對(duì)高品質(zhì)畜禽產(chǎn)品的需求。本文研究葎草乙醇提取物對(duì)小鼠腸道黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的影響，旨在開(kāi)發(fā)利用葎草作為新型資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系健康清潔級(jí)小鼠，公母各半，體重18±2.0 g,由福州吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 葎草，采自田野，切碎、烘干備用；實(shí)驗(yàn)室自配試劑：H.E.染色液，PAS染色液，MTB染色液。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 中藥破碎機(jī)(P158)；中藥磨粉機(jī)(M150)；超聲波清洗機(jī)(KQ-600DV)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100)；真空冷凍干燥機(jī)(ALPHA 2-4 LD)；徠卡切片機(jī)(LEICA RM 2016)；組織包埋機(jī)(LEICA EG 1150H)；麥克奧迪顯微攝影系統(tǒng)(BA310 Digital，CCD:Moticam2506)。

1.2 方法

1.2.1 葎草乙醇提取物的制備 葎草干燥粉碎，過(guò)100目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)量10 g置于廣口試劑瓶中，分別用20倍、15倍、10倍量70%乙醇浸泡，首次浸泡48 h后，超聲波溫度45 ℃，功率80%，分別超聲50 min、40 min和30 min，每次用布氏漏斗真空泵抽濾，合并3次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃～60 ℃回收乙醇，濃縮、離心，取上清液約10 mL，經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)凍干備用。

1.2.2 小鼠動(dòng)物試驗(yàn) 將32只健康小鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、低劑量組(100 mg/kg體重)、中劑量組(200 mg/kg體重)和高劑量組(300 mg/kg體重)，每組8只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后開(kāi)始試驗(yàn)，試驗(yàn)組小鼠按體重每天灌胃葎草乙醇提取物生理鹽水溶解液，對(duì)照組灌胃生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.3 樣品采集及處理 灌胃30 d后，每組隨機(jī)抽取5只小鼠，勁椎脫臼處死，剖檢，分別取每只小鼠十二指腸中段約5 cm，生理鹽水沖洗，浸泡在10%的甲醛固定液中。固定24 h后，取腸中段約1 cm，經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、常規(guī)石蠟切片后，分別進(jìn)行 H.E.、PAS染色和MTB染色。

1.2.4 十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)、杯狀細(xì)胞(GC)、肥大細(xì)胞(MC)數(shù)量的檢測(cè) H.E.染色和PAS染色的切片，選5根最長(zhǎng)、完好、走向平直的絨毛，分別顯微鏡觀察計(jì)數(shù)IEL和GC，計(jì)數(shù)每 100 個(gè)腸黏膜柱狀上皮細(xì)胞間的淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量；MTB染色，光鏡下計(jì)數(shù)每根腸管橫斷面的腸壁全層(包括黏膜及黏膜下層、肌層及漿膜層)的肥大細(xì)胞數(shù)量[3]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件的0ne—WayANOVA法進(jìn)行方差分析，差異顯著后進(jìn)行Duncan氏多重比較，以P<0.01(差異極顯著)，P<0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 各劑量組對(duì)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和中插彩版圖1。

表1 葎草乙醇提取物不同劑量對(duì)小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，含相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下表同

由表1可知，葎草乙醇提取物各劑量組與對(duì)照組比較，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量均增加，但低、高劑量組差異不顯著(P>0.05)，中劑量組差異極顯著(P<0.01)。中劑量與低、高劑量組比較差異不顯著(P>0.05)。

中插彩版圖1中箭頭所指細(xì)胞為上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)，經(jīng)H.E.染色后，小鼠IEL以小型淋巴細(xì)胞為主，為染色較深的近似小圓點(diǎn)，多分布于上皮的基底膜附近。

2.2 各劑量組上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和中插彩版圖2。

由表2可知，葎草乙醇提取物各劑量組與對(duì)照組比較，低、中劑量組的杯狀細(xì)胞數(shù)量差異極顯著(P<0.01)，高劑量組差異不顯著(P>0.05)。中劑量組與高劑量組比較差異極顯著(P<0.01)，與低劑量組比較差異不顯著(P>0.05)。

表2 葎草乙醇提取物不同劑量對(duì)小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

中插彩版圖2中箭頭所指細(xì)胞為上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞(GC)，一般靠近腸腺部位分布集中，靠近絨毛頂端的杯狀細(xì)胞呈散在分布，經(jīng)PAS染色后杯狀細(xì)胞呈紫紅色，高腳杯狀。

2.3 各劑量組對(duì)腸黏膜肥大細(xì)胞數(shù)量的影響 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和中插彩版圖3。

表3 葎草乙醇提取物不同劑量對(duì)小鼠十二指腸黏膜肥大細(xì)胞數(shù)量的影響

由表3可知，葎草乙醇提取物各劑量組與對(duì)照組比較，十二指腸黏膜肥大細(xì)胞數(shù)量均增加，但低、高劑量組差異不顯著(P>0.05)，中劑量組差異極顯著(P<0.01)。中劑量組與低、高劑量組比較差異不顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 葎草乙醇提取物對(duì)小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響 腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)主要位于上皮內(nèi)基底膜之上的一種特殊的淋巴細(xì)胞群體，是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最先與外來(lái)抗原和病原微生物接觸的免疫活性細(xì)胞。具有抑制黏膜超敏反應(yīng)、中和外源細(xì)胞毒作用及分泌淋巴因子等多種功能。在腸黏膜的抗感染免疫、保持腸上皮細(xì)胞的完整性及調(diào)節(jié)對(duì)外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答方面均有重要作用[4]。其數(shù)量多少與腸道吞噬抗原能力和殺滅病原微生物效果有關(guān)[5-8 ]。因此IEL的數(shù)量可以反映小腸局部黏膜免疫屏障的完整及免疫防御功能的完善程度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，葎草乙醇提取物組十二指腸絨毛上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞均高于對(duì)照組，低劑量組提高12.66%，中劑量組提高53.07%，高劑量組提高26.21%，尤以中劑量組最為顯著(P<0.01)，結(jié)果表明葎草乙醇提取物中劑量能增加小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)免疫能力。這與石玉祥[9]、唐秀瑩[10]等人的研究結(jié)果較為一致。

3.2 葎草乙醇提取物對(duì)小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響 杯狀細(xì)胞(GC)是混在黏膜上皮中的黏液分泌型細(xì)胞，底部狹窄，頂部膨大，充滿(mǎn)黏原顆粒，H.E染色為藍(lán)色或空泡狀，多為空泡狀。PAS染色使杯狀細(xì)胞呈現(xiàn)突出而鮮明的紅色易于觀察。腸道杯狀細(xì)胞主要分泌黏蛋白(MUC)、腸三葉因子(ITF)和抵抗素樣分子β(RELMβ)等成分，這些分泌黏液構(gòu)成腸道表面覆蓋的一層保護(hù)性黏液屏障，是腸道固有免疫第一防線的重要組成部分。楊秀娟研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方制劑，能顯著提高斷奶仔豬小腸黏膜上皮間的杯狀細(xì)胞數(shù)量[11]，閆金坤研究發(fā)現(xiàn)給應(yīng)激小鼠灌服中藥提取物可以提高小腸黏膜GC數(shù)量[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低、中劑量葎草組十二指腸絨毛杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組和高劑量組，低劑量組提高46.02%，中劑量組提高51.86%，其中中劑量組差異最為顯著，說(shuō)明葎草乙醇提取物能誘導(dǎo)小鼠十二指腸絨毛杯狀細(xì)胞數(shù)量及分泌黏液增多，在腸道黏膜構(gòu)成很好的黏膜機(jī)械屏障，對(duì)機(jī)體腸黏膜起到較好的保護(hù)作用。

3.3 葎草乙醇提取物對(duì)小鼠十二指腸黏膜肥大細(xì)胞數(shù)量的影響 肥大細(xì)胞(MC)是胃腸道黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成成分之一，是一種天然免疫效應(yīng)細(xì)胞，受到刺激活化后分泌多種介質(zhì)參與黏膜免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原菌的清除能力。有研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞經(jīng)口注入黃芪多糖可使十二指腸MC數(shù)量增多[13]；給小鼠飼喂大蒜溶液可增加腸道中MC數(shù)量[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠灌胃葎草乙醇提取物可增加十二指腸黏膜中的MC數(shù)量，低劑量提高7.10%，中劑量提高33.73%，高劑量提高18.34%，中劑量(200 mg/kg體重)的效果優(yōu)于低、高劑量,使肥大細(xì)胞能更迅速的發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，提高機(jī)體的免疫力。

4 結(jié)論

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是腸道屏障的重要組成部分，與腸道上皮細(xì)胞相互作用、相互影響， 保護(hù)腸道免受細(xì)菌、病毒等微生物的粘附和入侵及防止異物的吸收，起到機(jī)體第一道防線的作用。而腸道屏障作用主要由IEL、GC和MC等免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子來(lái)完成[15-16]。本試驗(yàn)研究結(jié)果為葎草乙醇提取物能夠提高小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步增強(qiáng)腸道的黏膜免疫，保護(hù)了腸道的完整性與穩(wěn)定性，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，提高免疫力，為葎草的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

[1] 中國(guó)藥材公司．中國(guó)中藥資源志要[M]．北京:科學(xué)出版社,1994:190-191．

[2] 尹海波,王穎,鄭太坤,等．中國(guó)葎草屬植物的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,3(1):60-63.

[3] 寇濤,呂佳琪,李偉,等.母豬飼糧中添加精氨酸對(duì)仔豬腸道免疫細(xì)胞數(shù)量的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2014,26(8):2 077-2 084．

[4] 張玉仙,王文利,陳耀星.不同劑量乳豬壯對(duì)仔豬小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量變化的試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2012,48(5):37-39．

[5] 顧憲紅,張宏福,佘銳萍,等.斷奶日齡對(duì)仔豬腸黏膜形態(tài)的影響[J]．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(9):1 267-1 271．

[6] 楊玉榮,佘銳萍,張口俊,等．大豆生物活性肽對(duì)肉雞腸道黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和IgA+生成細(xì)胞的影響[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006，28(4):412-415．

[7] XU R J．Postnatal adaptation of the gastrointestinal tract in neonatal pigs：a possible role of milk-borne growth factors[J]．Livestock Production Science,2000,65:95-107．

[8] 詹冬玲,王淑萍,秦貴信.大豆中的致敏因子對(duì)早期斷奶仔豬的影響[J].吉林畜牧獸醫(yī)雜志,2002,17(5):4-7．

[9] 石玉祥,閆金坤,王雪.敏枸杞多糖對(duì)小鼠腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量、分布及對(duì)IL一2水平影響[J].食品科學(xué),2011,32(13):318-320

[10] 唐秀瑩,陳正禮,羅啟慧,等.大豆異黃酮對(duì)大鼠腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及瘦素長(zhǎng)型受體的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2013,39(3):343-350．

[11] 楊秀娟,劉 莉,劉 智.復(fù)方中藥制劑對(duì)仔豬小腸黏膜上皮間淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞數(shù)量和血清IL-2水平的影響[J]. 畜牧與獸醫(yī),2008,40(8):61-63．

[12] 石玉祥,閆金坤,王雪敏,等.中藥提取物對(duì)應(yīng)激小鼠腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量及IL一2水平的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2011,41(1):85-88．

[13] 王海鳳,郭兵.黃芪多糖對(duì)肉仔雞十二指腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)作用[J] 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(5):1 534-1 539．

[14] 王文利,張玉仙,陳耀星,等.不同濃度的大蒜溶液對(duì)小鼠小腸黏膜肥大細(xì)胞和IgA陽(yáng)性反應(yīng)物數(shù)量變化的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2010,2:16-18．

[15] 曹晉宜,韓軍麗,王友湘,等.瑞士乳桿菌對(duì)小鼠腸道黏膜和腸組織中細(xì)胞因子影響的研究[J].食品科學(xué),2009,30(1):338-342．

[16] 閆金坤,陳耀星,王子旭.雌激素對(duì)人鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量、分布的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(9):1 267-1 271．