周 巖，王 晴，韓 會，何宗澤，汪鳳蘭，邢鳳梅

(華北理工大學 護理與康復學院， 河北 唐山 063000)

研究論文

大鼠壓瘡早期的線粒體損傷

周 巖，王 晴，韓 會，何宗澤，汪鳳蘭，邢鳳梅*

(華北理工大學 護理與康復學院， 河北 唐山 063000)

目的探討大鼠壓瘡早期引起的線粒體損傷情況及其作用。方法將40只大鼠隨機分為5組(每組8只)。對照組(control組)大鼠不施壓；實驗組用特制壓力裝置對股薄肌處施壓(170 mmHg)2 h，放松0.5 h為一個循環(huán)(1C)，根據(jù)施壓循環(huán)不同又分為3C、6C、9C和12C組。HE染色法觀察受壓肌肉組織的病變；Western blot檢測Bcl- 2和Bax在受壓肌肉組織中的表達；透射電鏡觀察肌纖維和線粒體等超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果各實驗組隨著受壓循環(huán)的增加出現(xiàn)病理損傷并逐漸加重；與對照組相比各實驗組中Bcl- 2的表達均有顯著增加(P<0.05)，于3C組達到高峰，隨后下降；隨著受壓循環(huán)的增加Bax的表達逐漸增多(P<0.05)，于12C組達到高峰；各實驗組隨著受壓循環(huán)的增加肌纖維出現(xiàn)排列紊亂和溶解斷裂，線粒體嵴消失及空泡變性等逐漸加重的病理損傷。結(jié)論大鼠壓瘡早期發(fā)生了線粒體損傷并誘導了細胞凋亡。

壓瘡；缺血再灌注損傷；線粒體；凋亡

壓瘡(pressure ulcer，PU)是臥床患者的常見并發(fā)癥，發(fā)病率居高不下。關(guān)于壓瘡發(fā)生機制的探討，近年來缺血再灌注損傷被認為是壓瘡深部組織損傷最重要的機制[1]。2007年提出壓瘡6期分類，在原來4期基礎上增加了疑似深部組織損傷壓瘡和難以分期壓瘡[2]，并提出缺血再灌注損傷是其病理基礎。疑似深部組織損傷壓瘡肉眼觀察與Ⅰ期壓瘡無明顯差異，但具有隱匿性、損傷性和難愈性特點，臨床上稱為“難免性壓瘡”[1]，若能對此及時干預將有效防止壓瘡的發(fā)展。目前對于早期壓瘡尤其是隱匿性壓瘡的發(fā)生機制尚未明確，本實驗通過建立大鼠早期壓瘡模型，檢測相關(guān)凋亡蛋白及線粒體變化，初步探討線粒體損傷情況及在大鼠早期壓瘡中的作用，為有效防治早期壓瘡提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級成年雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量為250～300 g[ 華北理工大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(冀)2010- 0038 ]。將大鼠隨機分為5組，每組8只，即：對照組(control)和實驗組，實驗組又分為3C、6C、9C和12C組。

1.1.2 試劑：兔源Bcl- 2多克隆抗體、鼠源Bax單克隆抗體和鼠源β-Tubulin單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備：參照文獻[3]報道應用特制壓力裝置對大鼠施壓(170 mmHg)2 h，放松0.5 h為一個循環(huán)(1C)，分別施壓0、3、6、9和12個循環(huán)。造模過程中麻藥按需補充，每2.5 h腹腔注射給予5%葡萄糖和0.9%氯化鈉溶液1～2 mL/次。

1.2.2 標本采集：在實驗終點，冰上采集受壓肌肉組織標本，4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干水分，放于-80 ℃超低溫冰箱中備用；采集0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm體積的受壓組織標本，10 %多聚甲醛固定備用。

1.2.3 HE染色法：將固定好的受壓肌肉組織標本制成石蠟切片，應用光學顯微鏡觀察組織的病理學變化，采集圖片。

1.2.4 Western blot檢測：將受壓肌肉組織剪碎，加入PBS勻漿，離心后棄上清，加入裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)充分混勻，于冰上裂解30 min，15 000 r/min離心15 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度，蛋白分裝和變性，制備SDS-PAGE進行電泳。轉(zhuǎn)膜并用脫脂牛奶封閉2 h，孵育Bcl- 2、Bax和β-Tubulin一抗，4 ℃過夜。TBST沖洗，室溫孵育二抗2 h。TBST沖洗，ECL顯影，應用Image J 軟件分析Bcl- 2和Bax的表達量，并觀察Bcl- 2/Bax比值在各組間的變化。

1.2.5 透射電鏡分析：將制作好的受壓肌肉組織切片使用透射電鏡觀察肌纖維和線粒體等超微結(jié)構(gòu)的病理變化并采集圖片。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察各組大鼠受壓肌肉組織的病理學改變

對照組肌纖維排列緊密，形態(tài)正常，無病理改變；3C組肌纖維結(jié)構(gòu)較完整，排列較整齊；6C組肌纖維出現(xiàn)斷裂、溶解和排列紊亂等現(xiàn)象；9C組橫紋肌消失，肌纖維斷裂溶解嚴重，有少量炎性細胞浸潤，出現(xiàn)空泡樣變性；12C組肌纖維嚴重破壞，肌間隙明顯增寬，間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，并有玻璃樣變性等病理改變(圖1)。

2.2 Western blot檢測各組大鼠受壓肌肉組織中Bcl- 2、Bax表達水平化

1)與對照組相比，各實驗組Bcl- 2的表達均顯著升高(P<0.05)，于3C時達高峰(圖2，表1)。Bax在對照組有少量表達，隨著受壓循環(huán)的增加各實驗組Bax的表達與對照組相比逐漸增多(P<0.05)，于12C時達高峰(圖2，表1)。

2)與對照組相比，6C、9C和12C組Bcl- 2/Bax比值顯著降低，呈逐漸下降的趨勢(P<0.05)(表1)。

圖1 各組大鼠受壓肌肉組織的病理學改變Fig 1 Histopathological change of compressed muscle tissues in each group

圖2 各組大鼠受壓肌肉組織中Bax和Bcl- 2表達水平Fig 2 Expression of Bcl- 2, Bax protein in compressed muscle tissue of each group

groupBcl-2BaxBcl-2/Baxcontrol 0.57±0.03 0.32±0.02 1.79±0.153C 1.70±0.04* 0.92±0.05* 1.81±0.106C 1.30±0.09*# 1.49±0.06* 0.87±0.03*#9C 1.24±0.08*# 2.22±0.20 0.57±0.0912C 1.20±0.10*# 2.99±0.30* 0.40±0.03*△

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with 3C group;△P<0.05 compared with 9C group.

2.3 透射電鏡觀察各組大鼠受壓肌肉組織超微結(jié)構(gòu)的變化

對照組中肌纖維排列整齊緊密，線粒體形態(tài)完整，內(nèi)部的嵴及基質(zhì)整齊；3C組肌纖維形態(tài)基本正常；6C組肌纖維排列紊亂，開始出現(xiàn)斷裂和溶解，線粒體大小不等，嵴及基質(zhì)減少，有明顯擴張，可見空泡樣變性；9C組肌纖維溶解和斷裂嚴重，有明顯的水腫和空泡變性，部分線粒體出現(xiàn)溶解破裂，并有新生不成熟線粒體出現(xiàn)；12C組中出現(xiàn)大量肌纖維碎片，線粒體溶解進一步增多(圖3)。

3 討論

與皮膚組織相比，肌肉組織血管較豐富，對缺血和缺氧更為敏感，國外研究[4]指出皮膚和肌肉同時受壓后，肌肉組織更容易受到損傷，并認為肌細胞損傷是壓瘡發(fā)展的重要標志。光鏡觀察顯示，各實驗組大鼠肌肉組織損傷情況隨著受壓循環(huán)的增加逐漸加重、出現(xiàn)肌纖維排列紊亂、斷裂、溶解和變性等病理改變，間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，說明不完全缺血再灌注使受壓肌纖維遭到破壞，誘發(fā)了炎性反應等病理反應，造成了受壓肌肉組織的損傷。

線粒體通路是細胞凋亡的內(nèi)在途經(jīng)，Bcl- 2家族蛋白是凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素[5]，其中Bax具有促凋亡的作用，而Bcl- 2是典型的抑凋亡因子。Bcl- 2/Bax比值決定了細胞生存與否，也是反映線粒體功能的指標之一[6]。Bcl- 2/Bax比值增加，細胞趨于存活，疾病預后良好；比值減少，細胞趨于凋亡，疾病預后較差。結(jié)果顯示：Bax在對照組中有少量表達，在實驗組中隨著受壓循環(huán)的增加表達逐漸增多； Bcl- 2在對照組中有少量表達，于3C組時達高峰，后隨著受壓循環(huán)的增加逐漸減少；與對照組相比3C組Bcl- 2/Bax比值有所增加但不明顯，6C組、9C組和12C組中Bcl- 2/Bax比值呈逐漸降低的趨勢。說明正常狀態(tài)下Bax 和Bcl- 2在細胞內(nèi)保持一定的動態(tài)平衡來維持基本的代謝更新，在壓瘡初期受壓組織通過上調(diào)Bcl- 2的表達來抑制細胞凋亡，但隨著缺血再灌注損傷的逐漸加重，Bax表達增多，Bcl- 2表達受到抑制，導致線粒體膜通透性增加，引發(fā)細胞凋亡，肌纖維損傷加重，與光鏡觀察結(jié)果一致。故壓瘡早期應充分重視并及時干預可以阻止壓瘡的繼續(xù)發(fā)展，否則大量細胞凋亡會使壓瘡進一步惡化難以控制。

圖3 各組大鼠受壓肌肉組織超微結(jié)構(gòu)的變化Fig 3 Ultrastructural change of the compressed muscle tissue in each group

線粒體對缺血缺氧的變化尤其敏感[7]，受壓導致的不完全缺血缺氧會直接導致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，失去正常生理功能，甚至釋放凋亡啟動因子，引發(fā)細胞凋亡。觀察顯示，壓瘡初期線粒體體積增大，內(nèi)部嵴和基質(zhì)開始發(fā)生損傷，隨著受壓循環(huán)的增加，受壓肌肉組織中線粒體損傷明顯，甚至溶解破裂。這說明大鼠壓瘡早期線粒體受到嚴重損傷，并可能誘發(fā)了受壓肌細胞的凋亡。結(jié)合Western blot結(jié)果，各實驗組中Bax表達的逐漸升高、Bcl- 2/Bax比值的逐漸降低均會導致線粒體膜通道的開放，結(jié)構(gòu)受損，釋放凋亡啟動因子，誘發(fā)凋亡，最終加重受壓肌肉組織的損傷。

綜上所述，在大鼠壓瘡早期隨著局部組織受壓循環(huán)的增加，促凋亡因子表達逐漸增多，線粒體出現(xiàn)損傷并逐漸加重，受損的線粒體釋放凋亡啟動因子，誘發(fā)了肌細胞的凋亡，這可能促進了早期壓瘡及難免性壓瘡的發(fā)生及其惡化。

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Mitochondrial damage in early stage of pressure ulcer in rats

ZHOU Yan, WANG Qing, HAN Hui, HE Zong-ze, WANG Feng-lan, XING Feng-mei*

(College of Nursing and Rehabilitation, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo investigate the mitochondrial damage and its effect in early stage of pressure ulcer in rats.MethodsForty rats were randomly divided into 5 groups(n=8), control group(Con group) rats without stress, the experimental group was treated with of 170 mmHg for 2 h and relax 0.5 h as one cycle(1C), experimental group was divided into 3C, 6C, 9C and 12C group. The pathological changes of the compressed muscle tissue of the rats in each group were observed by HE staining, Western blot was used to detect the expression of Bcl- 2 and Bax in the compressed tissue, and the ultrastructure of muscle fibers and mitochondria were observed by transmission electron microscope.ResultsThere were pathological damage and gradually increased in the experimental groups, with the increase of compression cycle; the expression of Bcl- 2 in each experimental group was significantly increased as compared with the control group(P<0.05), in the 3C group reached the peak, and then decreased; the expression of Bax was increased gradually with the increase of compression cycle(P<0.05), and in the 12C group reached the peak; with the increase of the compression cycle the muscle fibers of each experimental group appeared gradually increased pathological damage: disorder, dissolution and fracture, the ridge of the mitochondria disappeared, vacuolar degeneration,etal.ConclusionsIn the early stage of pres-sure ulcer in a rat, it brings occurred mitochondrial damage and induces apoptosis.

pressure ulcer; ischemia/reperfusion injury; mitochondria; apoptosis

2016- 11- 24

2017- 03- 24

省科技廳基金項目(16277787D)；華北理工大學研究生創(chuàng)新項目(2016S29)

*通信作者(correspondingauthor)：shanxing06@aliyun.com

1001-6325(2018)01-0042-05

R632.1

A