呂祝章，張 娜，邱麗娟

(1.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東日照 276826；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程，農(nóng)業(yè)部作物種質(zhì)資源利用重點開放實驗室，北京 100081)

野生種質(zhì)拓寬中國大豆遺傳基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記分析

呂祝章1*，張 娜1，邱麗娟2

(1.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東日照 276826；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程，農(nóng)業(yè)部作物種質(zhì)資源利用重點開放實驗室，北京 100081)

【目的】鑒定和發(fā)掘野生大豆種質(zhì)可利用的優(yōu)異等位變異，為進(jìn)一步有效地利用野生大豆資源開展大豆分子輔助育種工作提供參考信息?！痉椒ā坎捎肧SR標(biāo)記技術(shù)對具有野生大豆血緣的大豆推廣品種及其親本進(jìn)行遺傳變異性分析?！窘Y(jié)果】10個大豆育成品種分別遺傳利用了野生大豆和栽培大豆親本的19個和10個特有等位變異，并產(chǎn)生了其親本不具有的18個新的等位變異；野生大豆的小粒、高硬脂酸含量、多莢以及抗胞囊線蟲等優(yōu)良性狀基因較易被其育成的大豆品種選擇利用。【結(jié)論】野生和栽培大豆的種間雜交并不單純是遺傳物質(zhì)的簡單組合，它可以通過基因的重組創(chuàng)造出新的優(yōu)良基因型種質(zhì)。因而利用野生大豆特有的等位變異創(chuàng)造新的基因型，擴大栽培大豆的遺傳多樣性，進(jìn)而拓寬大豆的遺傳基礎(chǔ)是有效和可行的途徑。

野生大豆；育成品種；遺傳基礎(chǔ)；等位變異；SSR

種質(zhì)資源是基因的載體，是進(jìn)行遺傳改良和育種的基礎(chǔ)，正確評定種質(zhì)資源的變異特點，確定其間的遺傳變異關(guān)系，從中發(fā)掘有利基因，有利于正確制訂育種策略，進(jìn)而可實現(xiàn)定向培育目標(biāo)良種和加快育種進(jìn)程。我國育成世界上第1個大豆雜交種“雜交豆1號”則是完全得益于對野生大豆資源中不育基因的發(fā)現(xiàn)與利用。

我國是大豆的發(fā)源地，有占世界90％以上的豐富的野生大豆資源。野生大豆遺傳多樣性豐富，有些性狀是其所特有的基因資源[1-8]。我國大豆育種工作者已先后利用野生大豆資源創(chuàng)新培育出獲國家發(fā)明獎的鐵豐18號、吉林小粒1號，獲省級科技進(jìn)步獎的雜交豆1號、龍品8807、龍小粒豆1號，以及通過國家和省審定推廣應(yīng)用等品種共18個；另創(chuàng)新培育出180余份各具優(yōu)良特性的入選國家種質(zhì)庫的穩(wěn)定新種質(zhì)資源[9-11]。在世界范圍內(nèi)解析由野生大豆衍生而來的、具有豐富表型變異的大豆推廣品種與其親本間的遺傳結(jié)構(gòu)、特異性及其遺傳關(guān)系，對于發(fā)掘特異基因，拓寬大豆遺傳基礎(chǔ)，改良現(xiàn)實生產(chǎn)應(yīng)用品種具有重要的理論價值和實際意義，而此類研究還鮮見報道。

本研究選用10個利用野生大豆資源育成的大豆推廣品種及其17個親本，對分布于全基因組的具有多態(tài)性的88個SSR座位進(jìn)行分析，旨在分子水平上明確大豆育成品種與親本間的遺傳變異特點，探索利用野生大豆資源拓寬我國大豆遺傳基礎(chǔ)的趨勢，揭示育成品種優(yōu)異的基因來源，鑒定和發(fā)掘野生大豆種質(zhì)可利用的重要基因及標(biāo)記，為進(jìn)一步有效地利用野生大豆資源開展大豆育種工作提供參考信息。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用了10個具有野生血緣的在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的大豆品種及其17個親本。各品種的系譜情況如下：

龍小粒豆1號=黑農(nóng)26×ZYD652**；

龍品8807=黑農(nóng)35×ZYD355**，91-806=黑農(nóng)35×ZYD665**；

吉林小粒1號=平頂四×GD50477**；

吉林小粒4號=吉林18號×(通農(nóng)9號×GD50444-1**)；

吉林小粒6號=公野9140-5*×公野8648*；

吉林小粒7號=公野9140*×黑龍江小粒豆；

吉林66號=吉林30×(吉林27×GD50279**)；

中野1號=(察隅1號×ZYD3576**)×大灣大粒；

中野2號=(察隅1號×ZYD3576**)×大灣大粒。

*和**分別代表半野生和野生大豆，上述材料中的黑龍江小粒豆、察隅1號未被搜集到。

1.2 實驗方法

1.2.1 SSR分析

每份材料是從入庫的500g純凈種子中隨機取出100粒種子磨粉混勻，采用SDS法[12]提取DNA。PCR反應(yīng)體系為20μL，其中含有40ng基因組DNA模板、1×PCR 緩沖液、1.25mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、0.2μmol/L SSR引物和1U Tag DNA聚合酶。選用分布于全基因組的88對SSR標(biāo)記進(jìn)行分析，SSR引物序列來自大豆數(shù)據(jù)庫(http：//soybase.agron.iastate.edu/ssr.html)，由奧科生物技術(shù)公司合成。反應(yīng)在PE-9600型號的PCR擴增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性4min；95℃變性30s，47℃退火30s，72℃延伸30s，運行35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺、8 mol/L尿素制成的測序膠分離，銀染技術(shù)檢測。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個SSR位點，根據(jù)標(biāo)記條帶的有無記錄并統(tǒng)計等位變異出現(xiàn)數(shù)目進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 育成品種產(chǎn)生新的等位變異分析

10個大豆育成品種共檢測到264個等位變異，其中在LGB1 Satt453，LGB2 Satt556，LGC2 Satt286，LGD1a Satt179(3 個)，LGD1b Satt005，LGD2 Satt226，LGG Sat_164，LGH Satt302 (3 個)，LGK Satt559(2個)、Satt588，LGL Satt229，LGM Satt175，LGN Satt387等13個位點上產(chǎn)生了18個新的等位變異(表1)，新的等位變異占其等位變異總數(shù)的6.82％。育成品種產(chǎn)生新的特有等位變異情況見表2。

2.2 育成品種遺傳利用野生大豆親本特有等位變異分析

9個野生和半野生大豆親本共檢測到了339個等位變異，與8個栽培大豆親本相比共擁有110個特有等位變異，分布于15個連鎖群的61個位點上(表1)，占其等位變異總數(shù)的32.45％。其中在LGA1 Satt591，LGB2 Satt304，LGC1 Satt294、Satt180，LGC2 Satt291、Sat_252，LGD1a Satt184，LGD2 Satt014，LGG Satt012，LGH Satt192，LGI Sat_219、Satt239，LGL Satt 232、Satt446、Sat_099，LGN Satt387 等 16 個位點上的19個特有等位變異被6個育成的大豆品種所利用，特有等位變異利用率達(dá)17.27％。特有等位變異

被利用的情況為：龍品8807遺傳利用了ZYD355在Satt294(3 個)、Sat_099(2 個)、Satt291、Sat_252、Sat_219、Satt232、Satt446等7個位點上共10個特有等位變異；吉林小粒1號遺傳利用了野生大豆GD50477 在Satt180、Sat_252、Satt014、Satt184、Satt 239、Satt387等6個位點上的6個特有等位變異；吉林小粒6號遺傳利用了半野生大豆公野8648在Satt012、Satt192位點上的各1個特有等位變異；吉林小粒4號、中野1號、吉林66號分別遺傳利用了野生大豆GD50444-1在Satt591、野生大豆ZYD3576在Satt304、野生大豆GD50279在Satt012位點上的各1個特有等位變異(見表3)。分析發(fā)現(xiàn)有4個育成品種未遺傳利用到其野生親本在本研究中檢測到的特有等位變異，可能是由于其野生親本特有等位變異數(shù)少，亦或是由于育種目標(biāo)定向選擇造成。

表1 88個SSR位點在連鎖群上的等位變異分布Table 1 88 SSR locus distributed on the different Linkage Groups for cultivated and wild soybeans

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 育成品種產(chǎn)生特有等位變異情況Table 2 The variation of specific alleles in breeding cultivars

2.3 育成品種遺傳利用栽培大豆親本特異等位變異分析

8個栽培大豆親本共檢測到259個等位變異，與野生大豆親本相比僅擁有30個特有等位變異，分布于16個連鎖群上的25個位點(表1)，占其等位變異總數(shù)的11.58％，顯著低于野生大豆親本的32.45％；其中分布于LGD1a Satt179、LGE Satt268、LGG Satt199、LGI Sct_189、LGJ Satt244(2 個)、LGK Satt588，LGL Satt229(2個)、Satt373等8個位點上的10個特有等位變異被其育成品種所利用，特有等位變異利用率為33.33％，反而高于野生大豆親本的17.27％。這表明野生大豆與栽培大豆之間不僅在形態(tài)上有較大的區(qū)別，而且在遺傳基礎(chǔ)上也存在著明顯的差異，栽培大豆的特有等位變異在遺傳育種上更容易被遺傳并加以選擇和利用，這可能是由于其性狀更適合育種選擇的目標(biāo)所致。特有等位變異被育成品種利用的分析結(jié)果見表4。

表3 育成品種利用野生大豆特有等位變異情況Table 3 The variation of specific alleles in wild soybean varieties

3 討論與結(jié)論

不同的野生大豆材料共有且分布在A1連鎖群與脂肪含量有關(guān)的Satt591[13]，B2連鎖群與粒重有關(guān)的Satt304[14]，C1連鎖群與產(chǎn)量和粒重有關(guān)的Satt294[15]，C1連鎖群與脂肪和硬脂酸含量有關(guān)的Satt180[16]，C2連鎖群與產(chǎn)量和粒重有關(guān)的Satt291[15]和與產(chǎn)量、株高有關(guān)的Sat_252[16]，D1a連鎖群與百粒重有關(guān)的Satt184[17]，D2 連鎖群與百粒重有關(guān)的 Satt014[18]，G連鎖群與鐵營養(yǎng)和抗胞囊線蟲有關(guān)的Satt012[19-22]，I連鎖群與莢粒數(shù)有關(guān)的Sat_219[23]和與葉片大小、株高、開花期、莢粒數(shù)及脂肪含量有關(guān)的 Satt239[18，23-25]，L連鎖群與倒伏性有關(guān)的Satt232[26]以及與粒重有關(guān)的 Sat_099[14，27]，N連鎖群與產(chǎn)量和株高有關(guān)的Satt387[28-29]等位點上的特異等位變異被育成品種利用。從此可以看出野生大豆的小粒、高硬脂酸含量、多莢以及抗胞囊線蟲等優(yōu)良性狀易被育成品種選擇利用。

在10個育成品種中共產(chǎn)生了18個新的等位變異，即部分座位在育成品種中產(chǎn)生了不同于雙親的帶型，發(fā)生了變異。DNA變異中，新雜交帶的產(chǎn)生及親本帶的丟失，表明DNA產(chǎn)生了復(fù)制和丟失，雜交帶大小的變化可能與堿基甲基化，DNA重排及轉(zhuǎn)座等機制有關(guān)[30-31]。引起基因組中某些DNA片段發(fā)生同源重組、插入、缺失等，從而造成該片段分子量的增加或減少，因而可以表明野生和栽培大豆的種間雜交并不單純是遺傳物質(zhì)的簡單組合，更重要的是它可以通過基因的重組創(chuàng)造出新的優(yōu)良基因型種質(zhì)。

表4 育成品種利用栽培大豆特有等位變異情況Table 4 The variation of specific alleles of cultivated soybean cultivars

野生大豆是未經(jīng)過人工選擇的材料，遺傳背景復(fù)雜，遺傳多樣性較為豐富。作為栽培大豆近緣祖先種—野生大豆的潛在價值應(yīng)該受到更進(jìn)一步的重視、開發(fā)與利用，充分挖掘和發(fā)揮野生大豆的資源優(yōu)勢，必將會為大豆育種工作帶來新的活力和突破性進(jìn)展。

[1] 蓋鈞鎰，許東河，高忠，等.中國栽培大豆和野生大豆不同生態(tài)類型群體間遺傳演化關(guān)系的研究[J].作物學(xué)報，2000，26(5)：513-520.

[2] 李向華，田子罡，李福山.新考察收集野生大豆與已保存野生大豆的遺傳多樣性比較[J].植物遺傳資源學(xué)，2003，4(4)：345-349.

[3] 田清震，蓋鈞鎰，喻德躍，等.我國野生大豆與栽培大豆AFLP指紋圖譜研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34(5)：480-485.

[4] 趙洪錕，王玉民，李啟云，等.中國不同緯度野生大豆和栽培大豆SSR分析[J].大豆科學(xué)，2001，20(3)：172-176.

[5] 周曉馥，莊炳昌，王玉民，等.利用RAPD與SSR技術(shù)進(jìn)行野生大豆種群內(nèi)分化的研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，10(4)：6-9.

[6] 何真，韻曉東，武凱，等.大豆種質(zhì)資源遺傳多樣性研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2015，5(2)：103-108.

[7] 李為民，李思鋒，黎斌，等.DNA分子標(biāo)記在野生大豆遺傳多樣性研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30(21)：246-250.

[8] 張樂，李英慧，劉章雄，等.栽培大豆(G.max)和野生大豆(G.soja)～Glymal3g21630基因多樣性[J].作物學(xué)報，2011，37(10)：1724-1734.

[9] 楊光宇，王洋，馬曉萍，等.小粒大豆新品種吉林小粒6號選育報告[J].中國農(nóng)業(yè)信息，2008(4)：19.

[10] 楊光宇，王洋，馬曉萍，等.出口專用大豆新品種吉林小粒7號選育報告[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，30(5)：24-25.

[11] 楊明亮，張東梅，常玉森，等.特用大豆優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源利用與創(chuàng)新[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016(8)：15-18.

[12] 關(guān)榮霞，常汝鎮(zhèn)，邱麗娟.用于SSR分析的大豆DNA的快速提取[J].大豆科學(xué)，2003，21(1)：73-74.

[13] HYTEN D L，PANTALONE V R，SAMS C E，et al.Seed quality QTL in a prominent soybean population[J].Theoretical Applied Genetics，2004，109(3)：552-561.

[14] ORF J H，CHASE K，JARVIK T，et al.Genetics of soybean agronomic traits I Comparison of three related recombinant inbred populations[J].Crop science，1999，39(6)：1642-1651.

[15] YUAN J，NJITI V N，MEKSEM K，et al.Quantitative trait loci in two soybean recombinant inbred line populations segregating for yield and disease resistance[J].Crop Science，2002，42(1)：271-277.

[16] 鄭永戰(zhàn)，蓋鈞鎰，盧為國，等.大豆脂肪及脂肪酸組分含量的QTL定位[J].作物學(xué)報，2006，32(12)：1823-1830.

[17] PANTALONE V，PANTHEE DR，SAMS C E，et al.Quantitative trait loci for seed protein and oil concentration and seed size in soybean[J].Crop Science，2005，45(5)：2015-2022.

[18] CHAPMANA，PANTALONE V R，USTUN A，et al.Quantitative trait loci for agronomic and seed quality traits in an F2 and F4：6 soybean population[J].Euphytica，2003，129(3)：387-393.

[19] CONCIBIDO V C，DIERS B W，ARELLI P R.A decade of QTL mappingforcystnematoderesistance in soybean[J].Crop Science，2004，44(4)：1121-1131.

[20] 高利芳，郭勇，郝再彬，等.大豆株高QTL的“整合”及Overview分析[J].遺傳，2013，35(2)：215-224.

[21] 陳慶山，張忠臣，劉春燕，等.大豆主要農(nóng)藝性狀的QTL分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(1)：41-47.

[22] 張聞博，蔣洪蔚，李燦東，等.基于元分析的大豆胞囊線蟲抗性QTL的整合[J].中國油料作物學(xué)報，2010，32(1)：104-109.

[23] 張軍，趙團(tuán)結(jié)，蓋鈞鎰.大豆育成品種農(nóng)藝性狀QTL與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析[J].作物學(xué)報，2008，34(12)：2059-2069.

[24] 文自翔，趙團(tuán)結(jié)，鄭永戰(zhàn)，等.中國栽培和野生大豆農(nóng)藝品質(zhì)性狀與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析I.群體結(jié)構(gòu)及關(guān)聯(lián)標(biāo)記[J].作物學(xué)報，2008，34(7)：1169-1178.

[25] 文自翔，趙團(tuán)結(jié)，鄭永戰(zhàn)，等.中國栽培和野生大豆農(nóng)藝及品質(zhì)性狀與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析II.優(yōu)異等位變異的發(fā)掘[J].作物學(xué)報，2008，34(8)：1339-1349.

[26] SPECHT J E，CHASE K，MACRANDE M，et al.Soybean response to water：A QTL analysis of drought tolerance[J].Crop Science，2001，41(2)：493-509.

[27] ADLER F R，CHASE K，LARK K，et al.Genetics of soybean agronomic traits：II.Interactions between yield quantitative trait loci in soybean[J].Crop Science，1999，39(6)：1652-1657.

[28] BAIANU I C，DIERS B W，F(xiàn)EHR W R，et al.Putative alleles for increased yield from soybean plant introduction[J].Crop Science，2004，44(3)：784-791.

[29] 楊勝先，牛遠(yuǎn)，李夢，等.栽培大豆農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析及優(yōu)異等位變異挖掘[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47(20)：3941-3952.

[30] WALBOT V.On the life strategies of plants and animals[J].Trends in Genetics，1985，1(6)：165-169.

[31] WALBOT V，CHANDLER V，Taylor L.Alterations in the Mutator transposable element family of Zea mays[C].UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology，1985(35)：333-342.

SSR Marker Analysis on Genetic Basis of Wild Germplasm in China

LYU Zhu-zhang1*，ZHANG Na1，QIU Li-juan2
(1.Rizhao Polytechnic College，Rizhao 276826，Shandong，China；2.Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences/The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Crop Germplasm and Utilization，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China)

【Objective】To identify and explore the excellent allelic variation of wild soybean germplasm，and provide reference information for excavating the excellent genetic resources of wild soybean efficiently by molecular assisted breeding.【Method】The SSR markers were used to analyze the genetic variability of soybean cultivars and their parents with wild soybean genetic background.【Results】10 soybean cultivars were genetic use of wild soybean and cultivated soybean were 19 and 10 unique alleles，and had their parents with 18 new alleles；soybean varieties of small，wild soybean high stearic acid content，pod and cyst nematode resistance and other excellent genes easily bred by the breeding varieties.【Conclusion】Interspecific hybridization between wild and cultivated soybeans is not just a simple combination of genetic material，it can create a new excellent genotype by genetic recombination.Therefore，those marker genotypes in wild soybean could be directly used to creating a new genotype through the marker-assistant selection，to expand the genetic diversity and broaden the genetic basis of soybean.

wild soybean；breeding variety；genetic basis；allelic variation；SSR

S565.1

A

1000-2650(2017)01-0010-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.01.002

2016-12-05

國家自然科學(xué)基金(30490250)。

呂祝章，博士，教授，主要從事油料作物遺傳育種和分子生物學(xué)研究，E-mail：ytzhuzhang@163.com。

(本文審稿：武 晶；責(zé)任編輯：劉詩航；英文編輯：劉詩航)