高澤成，吳曉云，梁春年，李明娜，閻 萍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，蘭州 730050)

兩種毛色牦牛皮膚黑色素組織學(xué)分析

高澤成1，2，吳曉云1，梁春年1，李明娜1，閻 萍1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，蘭州 730050)

【目的】觀察兩種不同毛色的牦牛皮膚中黑色素分布。【方法】采用冰凍切片和石蠟切片技術(shù)，用甲苯胺藍(lán)和HE染色進(jìn)行組織學(xué)分析?！窘Y(jié)果】?jī)煞N切片方法均能展現(xiàn)毛囊結(jié)構(gòu)、皮膚組織分層結(jié)構(gòu)。甲苯胺藍(lán)染色：石蠟切片比冰凍切片著色較淺，易觀察到黑色素的分布；冰凍切片通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)牦牛毛囊由毛鞘、毛乳頭和毛球外圍的結(jié)締組織形成。HE染色：冰凍切片著色較深，皮膚結(jié)構(gòu)層次分明；石蠟切片著色均勻，細(xì)胞分布明顯。【結(jié)論】天祝白牦牛表皮的基底層和毛囊周圍發(fā)現(xiàn)分布著少量的黑色素。大通牦牛的毛囊和表皮中均發(fā)現(xiàn)有大量黑色素的存在。大通牦牛毛囊中與毛發(fā)相連毛乳頭附近的黑色素含量比毛囊周圍其他部位含量高，皮膚表皮基底層相對(duì)毛囊黑色素含量少。大通牦牛毛囊周圍黑色素比天祝白牦牛密集，且更為明顯。大通牦牛的毛囊群比天祝牦牛毛囊群密集，毛囊的直徑比天祝牦牛的長(zhǎng)，毛發(fā)較粗。石蠟切片的HE染色是比較好的方法。

牦牛；甲苯胺藍(lán)染色；HE染色；黑色素

動(dòng)物的毛發(fā)是由毛囊發(fā)育生長(zhǎng)的皮膚衍生物，毛色是動(dòng)物重要特征之一，它在確定雜交組合、品種純度和親緣關(guān)系以及評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量等方面均有使用價(jià)值。有研究發(fā)現(xiàn)毛色與生長(zhǎng)速度、瘦肉率及抗病力等均有直接關(guān)系[1]。毛囊解剖學(xué)與形態(tài)發(fā)生學(xué)研究已經(jīng)證明，哺乳動(dòng)物毛發(fā)著色主要來源于毛球毛母細(xì)胞間成熟黑色素細(xì)胞合成的色素[2]。

黑色素顆粒的多少、顆粒性狀及分布決定毛發(fā)的顏色。生長(zhǎng)期結(jié)束的特征是黑色素細(xì)胞樹突收縮，黑色素生成停止[3]。黑色素細(xì)胞主要分布在皮膚和毛囊中，視網(wǎng)膜上皮、虹膜、眼葡萄膜、軟腦膜和內(nèi)耳中也有少量分布[4-5]。毛囊黑色素細(xì)胞合成的黑色素主要用于形成毛色，具有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性[6]。謝光耀等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黑色素細(xì)胞在烏骨羊表皮基底層和毛囊中大量分布，并且黑色被毛的毛囊外根鞘部位的黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)活化狀態(tài)，是黑色皮膚和黑色毛發(fā)的主要來源。

牦牛是青藏高原與藏民族的生產(chǎn)生活密切相關(guān)的動(dòng)物，被譽(yù)為“高原之舟”。牦牛毛、絨制品深受喜愛，因此研究牦牛毛色有著重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益，本文擬對(duì)兩種不同毛色的牦牛皮膚中黑色素分布進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 采樣

3頭純黑色被毛青海省大通成年牦牛和3頭純白色被毛天祝成年牦牛。皮膚組織樣品采集：大通純黑色被毛和天祝純白色被毛均取自背部左側(cè)(見圖1)；液氮和福爾馬林固定液保存。

1.1.2 儀器和試劑

石蠟切片機(jī)(Leica RM2235)，石蠟包埋機(jī)(Leica EG1150H)、組織全自動(dòng)脫水機(jī)(Leica ASP300S)、德國(guó)萊卡冰凍切片機(jī)，德國(guó)萊卡冰凍包埋劑(JUNG tissue freezing medium)，顯微鏡(Leica DM5500B)、H.E染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，甲苯胺藍(lán)。載玻片、蓋玻片、染缸、干燥箱、中性樹脂、梯度酒精(100％、95％、90％、80％、70％)、二甲苯、蒸餾水。

1.1.3 冰凍切片的制作

取出液氮保存的組織，待組織變軟修塊，剪去組織樣表皮毛發(fā)，大小4mm×4mm×3mm。組織塊放入冰凍切片包埋盒中，加入冰凍包埋劑，置-20℃冰箱冷凍，進(jìn)行切片。分別用甲苯胺藍(lán)和HE染色，鏡檢。

1.1.4 石蠟切片的制作

取樣，修塊，大小為4mm×4mm×3mm；脫水：自來水洗24h，5％苯酚(24h)使組織軟化，脫水70％(1)、80％(1)、90％(2)、95％(2)、100％(Ⅰ、Ⅱ各 1h)，二甲苯透明(Ⅰ、Ⅱ各 1h)，浸蠟(24h)，包埋，修塊，切片，展片(40℃)。進(jìn)行甲苯胺藍(lán)和HE染色。

2 結(jié)果

2.1 冰凍切片

2.1.1 甲苯胺藍(lán)染色

圖1 大通牦牛與天祝白牦牛Figure 1 Datong yak and Tianzhu white yak

甲苯胺藍(lán)是一種堿性染料，屬于噻嗪類染料，可作為細(xì)胞核染劑[8]。兩種被毛顏色皮膚組織均能較好的顯示牦牛皮膚的黑色素分布。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，牦牛皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)與常見哺乳動(dòng)物皮膚結(jié)構(gòu)大體相似，表皮角質(zhì)層較薄，真皮層較厚，顯示皮膚結(jié)構(gòu)和黑色素顆粒的分布情況。黑色被毛的毛根、外根鞘、毛髓質(zhì)有大量的黑色素顆粒存在，毛乳頭黑色素?cái)?shù)量相對(duì)較少。在白色被毛毛囊中的毛根部位有少量黑色素顆粒存在，在毛囊的其他部位未發(fā)現(xiàn)，但在皮膚表皮基底層有少量黑色素顆粒存在(見圖2)。

2.1.2 HE染色

經(jīng)過HE染色可以明顯地觀察到黑色素顆粒的分布。可以更加清晰的觀察皮膚組織結(jié)構(gòu)分層，真皮層是表皮層的15～20倍。首先黑色被毛毛干中黑色素顆粒分布最多，在毛乳頭、外根鞘、皮膚表皮基底層有黑色素顆粒的分布。毛發(fā)中的黑色素顆粒比皮膚中的黑色素顆粒更加密集。其次在白色被毛皮膚組織中觀察到在毛發(fā)的毛乳頭、外根鞘沒有發(fā)現(xiàn)黑色素顆粒的分布，但在皮膚的表皮基底層發(fā)現(xiàn)有少量黑色素顆粒的存在。數(shù)量和密度均比黑色被毛少和小(未作統(tǒng)計(jì))(見圖3)。

2.2 石蠟切片

2.2.1 甲苯胺藍(lán)染色

顯微鏡下清晰地看到真皮層的毛囊、毛發(fā)的結(jié)構(gòu)、黑色素的分布。在毛發(fā)生長(zhǎng)過程中，基部的黑色素細(xì)胞不能看到有黑色素顆粒的生成，毛乳頭細(xì)胞位于毛球中央，是由大量的結(jié)締組織構(gòu)成。在天祝白牦牛的毛囊染色發(fā)現(xiàn)毛發(fā)的根部容易被染色劑著色，周圍的黑色素細(xì)胞沒有產(chǎn)生黑色素顆粒(見圖4)。

2.2.2 HE染色

普通的HE染色，黑色素不能清楚地顯示，但能清楚地顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在天祝白牦牛的表皮和毛囊周圍的黑色素細(xì)胞分布密集。大通牦牛毛囊中與毛發(fā)相連毛乳頭附近的黑色素含量比毛囊周圍其他部位含量高。在同一放大倍數(shù)視野下發(fā)現(xiàn)，大通牦牛的毛囊群比天祝白牦牛毛囊群密集，毛囊的直徑比天祝長(zhǎng)，毛發(fā)粗大。表皮黑色素細(xì)胞不規(guī)則，它們一般有形成空泡的趨勢(shì)，細(xì)胞核較大，成熟的黑色素細(xì)胞還有不明顯的樹突，有十?dāng)?shù)個(gè)細(xì)胞相互接觸，形成黑色素細(xì)胞簇，有的具有非典型的細(xì)胞核或者整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)出多形性，部分細(xì)胞還存在于真皮和表皮連接處的上方。大通牦牛毛囊周圍黑色素細(xì)胞比天祝白牦牛的多而且密集，細(xì)胞核大，而且更為明顯。毛囊是由毛鞘、毛乳頭和毛球外面周圍的結(jié)締組織形成的。大通牦牛毛囊周圍和表皮中的黑色素細(xì)胞均產(chǎn)生大量黑色素顆粒，數(shù)量多于天祝白牦牛(見圖5)。

圖2 冰凍切片甲苯胺藍(lán)染色Figure 2 Frozen section toluidine blue staining

圖3 冰凍切片HE染色Figure 3 Frozen section HE staining

圖4 石蠟切片甲苯胺藍(lán)染色Figure 4 Paraffin toluidine blue staining

圖5 石蠟切片HE染色Figure 5 Paraffin section of HE staining

3 討論

3.1 甲苯胺藍(lán)染色

皮膚組織中存在大量角化細(xì)胞和角化蛋白，采用HE染色，著色效果不好，試驗(yàn)采用甲苯胺藍(lán)染色研究牦牛的皮膚組織及毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)[9]。在天祝白牦牛中發(fā)現(xiàn)，盡管毛色純白，但經(jīng)過染色發(fā)現(xiàn)在皮膚表皮中也分布著數(shù)量較少的黑色素，牦牛生活在高海拔的地區(qū)，陽光的紫外線照射強(qiáng)烈，為了適應(yīng)環(huán)境，皮膚表皮的黑色素可以吸收紫外線，減少傷害。年輕的黑色素細(xì)胞可分裂，皮膚的顏色決定于表皮細(xì)胞內(nèi)黑色素的多少，而不決定于黑色素細(xì)胞的數(shù)目[10]。表皮基底層的黑色素細(xì)胞合成的黑色素主要用于形成膚色，具有保護(hù)作用，使機(jī)體免受紫外線傷害[11]。在大通牦牛中發(fā)現(xiàn)，有些皮膚表皮并沒有黑色素存在，但在毛囊周圍發(fā)現(xiàn)黑色素。黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素，并循黑色素細(xì)胞樹突沿途分送給角質(zhì)形成細(xì)胞，故后者不產(chǎn)生但卻含有黑色素。黑色素形如細(xì)小的棕色顆粒，存在于基底細(xì)胞之間。當(dāng)黑色素細(xì)胞向淺層移位時(shí)，這種顆粒漸漸消失，故淺層細(xì)胞中著色淺。黑色素主要是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生和存儲(chǔ)，黑色素細(xì)胞根據(jù)特征不同分為三個(gè)群體：第一類分布在表皮，它們只有少量黑色素沉積；第二類分布于毛囊外根鞘中，它們的形態(tài)較小，沒有黑色素分泌，但是能夠增生分化；第三類分布于毛球部，形態(tài)較大并且有大量黑色素分泌，但是卻不能增生分化[12-13]。毛囊黑色素細(xì)胞合成的黑色素主要用于形成毛色[14]。二是黑色素通過黑色素細(xì)胞樹枝狀突起，向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)移，然后隨表皮細(xì)胞上行至角質(zhì)層，隨著老化的膠質(zhì)細(xì)胞脫落排出體外[15]。

3.2 HE染色

HE染色法可以判斷黑色素細(xì)胞的位置和密度，皮膚分層結(jié)構(gòu)[16]。大通牦牛皮膚黑色素細(xì)胞分布在表皮基底部、毛球部和毛囊外根鞘部，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[17-18]。大通牦牛在毛囊周圍發(fā)現(xiàn)黑色素，同時(shí)在表皮基底層發(fā)現(xiàn)黑色素，在天祝毛白牦牛中發(fā)現(xiàn)，毛發(fā)純白，但經(jīng)過染色發(fā)現(xiàn)在表皮中分布著數(shù)量較少的黑色素。毛囊的黑色素細(xì)胞與表皮的黑色素細(xì)胞的調(diào)控機(jī)理不同或是傳到運(yùn)輸機(jī)理不同。甲苯胺藍(lán)染色能顯示黑色素的分布，有研究已經(jīng)證明，哺乳動(dòng)物毛發(fā)著色主要來源于毛球部毛母質(zhì)細(xì)胞間成熟黑色素細(xì)胞合成的色素[19]，而與毛囊所在皮膚組織中黑色素細(xì)胞的數(shù)量以及成熟度無關(guān)[2]。大通牦牛在毛囊及皮膚基底層發(fā)現(xiàn)黑色素在皮膚發(fā)育分化早期階段。烏皮羊與非烏皮羊黑色素細(xì)胞的遷移路線可能存在差異[20]。毛乳頭是毛發(fā)發(fā)生的部位，在毛發(fā)生長(zhǎng)中，毛囊周圍的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素經(jīng)過細(xì)胞之間的傳到運(yùn)輸，經(jīng)黑色素運(yùn)輸?shù)脚c毛發(fā)直接相連的毛乳頭部位，因此在毛囊中毛發(fā)的基部與毛乳頭相連接的部位黑色素密集。哺乳動(dòng)物毛發(fā)著色主要來源于毛球部毛母質(zhì)細(xì)胞間成熟黑色素細(xì)胞合成的色素，而與毛囊所在皮膚組織中黑色素細(xì)胞的數(shù)量以及成熟度無關(guān)[21]。

冰凍切片試講生物組織置于低溫下迅速凍結(jié)達(dá)到一定硬度后進(jìn)行切片的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。與常規(guī)石蠟切片相比，不經(jīng)過脫水、透明、浸蠟等步驟，因此組織不會(huì)收縮，容易保持原狀，具有快速、簡(jiǎn)便、易操作等優(yōu)點(diǎn)[22]。大通牦牛是野生牦牛與家養(yǎng)牦牛雜交品種，大通牦牛比天祝白牦牛生活海拔地區(qū)較高，環(huán)境更加惡劣復(fù)雜，粗大的毛囊可以生長(zhǎng)出較為粗長(zhǎng)的毛發(fā)，而且毛囊的密度比天祝白牦牛的密度大。這樣密集的毛發(fā)有利于大通牦牛適應(yīng)寒冷嚴(yán)酷的生活環(huán)境。

4 結(jié)論

甲苯胺藍(lán)染色比HE染色較容易看到黑色素顆粒的分布，但是不能很好地對(duì)黑色素細(xì)胞進(jìn)行染色；HE染色能充分的對(duì)黑色素細(xì)胞染色，能夠行處看到黑色素細(xì)胞的分布和形狀大小，細(xì)胞結(jié)構(gòu)。黑色素細(xì)胞見于毛囊中。也出現(xiàn)在表皮基底細(xì)胞之間和其上下方。石蠟切片著色效果好于冰凍切片，但冰凍切片保持組織的新鮮度能顯示黑色素的分布。

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Melanin Histologic Analysis of Yak Skin in Two Different Colors

GAO Ze-cheng1，2，WU Xiao-yun1，LIANG Chun-nian1，LI Ming-na1，YAN Ping1*
(1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS，Lanzhou，Key Laboratory of Yak Breeding Engineering of Gansu Province，Lanzhou 730050，China；2.Gansu Agricultural University College of Animal Science and Technology，Lanzhou 730050，China)

【Objective】To study the melanin distribution in two different coat colors of yak skin.【Methods】The experiment used frozen section and paraffin section technique，Toluidine blue and HE dye were used to histologic analysis.【Results】Two kinds of slice methods could show the hair follicle structure，stratification of the skin tissue structure.Toluidine blue staining：paraffin had shallower color than frozen,and easier for observing the distribution of melanin;frozen section showed that yak hair follicle was made up of wool sheath，hair papilla and the bulb outside the surrounding connective tissue formation through microscope.HE staining：frozen section was deeper colored,and had distinct skin structure；paraffin section colored uniformly，and cell distributed obviously.【Conclusions】A small amount of melanin was found in Tianzhu's skin and hair follicles and a large amount of melanin was found in Datong's skin and hair follicles.The hair dermal papilla near the melanin content in Datong yak hair follicles was higher than other parts around the hair follicles,and skin epidermal basal layer relatively less hair melanin content.Hair follicle melanocytes of Datong yak was denser than Tianzhu yak,and more obvious.Datong yak hair follicle group was denser，the diameter of the hair follicle was longer than Tianzhu and with thicker hair.Paraffin section with HE staining was a better method.

Yak；toluidinebluestaining；HEstaining；melanin

S813.1

A

1000-2650(2017)01-0110-06

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.01.017

2016-10-12

牦牛資源與育種創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛牦牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38)。

高澤成，碩士研究生，主要從事家畜分子生物學(xué)研究，E-mail：gaobee@163.com。*責(zé)任作者：閻萍，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：pingyanlz@163.com。

(本文審稿：陳正禮；責(zé)任編輯：秦碧雯；英文審稿：劉益平)