錢帥偉

摘 要：探討交通相關(guān)微粒（diesel exhaust particles，DEP）懸液急性滴注對(duì)心肌氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬和凋亡信號(hào)的影響及急性耐力運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)功能與干預(yù)作用。方法：8周健康雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con）、急性耐力運(yùn)動(dòng)組（AE）、急性染毒組（DEP）和急性耐力運(yùn)動(dòng)+染毒組（AE+DEP），每組均6只。DEP組和AE+DEP組進(jìn)行一次急性DEP染毒滴注（1 mg/kg）。隨后，AE組和AE+DEP組進(jìn)行一次75% ■O2 max的急性耐力跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（12 m/min，90 min）。運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)12 h后斷頸椎處死，摘取心臟。酶標(biāo)儀測(cè)心肌氧化應(yīng)激水平（MDA、SOD、CAT和H2O2等），Western blotting測(cè)心肌自噬相關(guān)蛋白（Atg5、LC3、P62、Beclin1和UVRAG等）和凋亡相關(guān)蛋白（Caspase 3和PARP等）表達(dá)水平。結(jié)果：1）DEP可使心肌MDA和H2O2含量顯著升高，CAT活性明顯下降，而急性耐力運(yùn)動(dòng)可顯著抑制DEP介導(dǎo)的心肌MDA和H2O2含量升高，并抑制CAT活性下降；2）DEP可顯著上調(diào)心肌自噬蛋白Atg5、LC3-Ⅱ表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，降低P62蛋白表達(dá)，但Beclin1通路自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1和UVRAG表達(dá)卻無顯著變化，而急性耐力運(yùn)動(dòng)可顯著抑制DEP介導(dǎo)的心肌Atg5和LC3-II蛋白表達(dá)升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率上調(diào)，并抑制P62蛋白表達(dá)下降，但對(duì)Beclin1和UVRAG蛋白表達(dá)未造成顯著影響；3）DEP可顯著上調(diào)心肌凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3和PARP的表達(dá)，而急性耐力運(yùn)動(dòng)可抑制心肌Caspase 3蛋白過量表達(dá)，并顯著降低PARP蛋白表達(dá)。結(jié)論：DEP可使心肌產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，致使心肌自噬通量水平過量增加，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。急性耐力運(yùn)動(dòng)可下調(diào)心肌氧化應(yīng)激水平，抑制DEP介導(dǎo)的心肌自噬過度激活和細(xì)胞凋亡。提示：急性耐力運(yùn)動(dòng)使心肌氧化應(yīng)激-自噬通量-凋亡信號(hào)具有向穩(wěn)態(tài)平衡方向發(fā)展的變化趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：急性耐力運(yùn)動(dòng)；心肌組織；交通相關(guān)微粒；氧化應(yīng)激；細(xì)胞自噬；凋亡信號(hào)

中圖分類號(hào)：G 804.4 文章編號(hào)：1009-783X（2017）06-0571-06 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Objective： To discuss the effects of diesel exhaust particles （DEP） on cardiac oxidative stress， autophagy flux and apoptosis signal， reveal the regulatory function and interventional effect of acute endurance exercise. Methods： Eight-week-old C57BL/6 mice were randomly divided into control group （Con）， acute endurance exercise group （AE）， acute DEP administration group （DEP） and acute endurance exercise combined with DEP group （AE+DEP）. DEP and AE+DEP groups were instilled DEP suspension （1mg/K歌） intratracheally. Later， AE and AE+DEP groups performed acute endurance treadmill running at a speed of 12m/min for 90 min after DEP suspension or saline administration. Mice were executed by breaking their cervical vertebra and hearts were excised after physical recovery for 12h. Microplate reader was used to detect cardiac oxidative stress level （MDA， SOD， CAT， H2O2， etc.）. Western blotting analysis was used to detect cardiac autophagy related proteins （Atg5， LC3， P62， Beclin1，UVRAG， etc.） and apoptosis related proteins （Caspase 3 and PARP）. Results： 1） DEP could significantly increase the contents of cardiac MDA and H2O2， as well as reduce the activity of SOD， while acute endurance exercise could reverse these abnormal changes. 2） DEP could significantly increase cardiac Atg5， LC3-Ⅱ protein levels and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ， reduce p62 protein level， while acute endurance exercise could reverse these abnormal changes. Both DEP and acute endurance exercise exert little effect on Beclin1and UVRAG protein levels. 3） DEP could significantly increase apoptosis related proteins （Caspase 3 and PARP） levels， while acute endurance exercise could reverse these abnormal changes. Conclusions： DEP could significantly up-regulate cardiac oxidative stress， excessively increase cardiac autophagy flux， and eventually lead to apoptosis. But acute endurance exercise could down-regulate cardiac oxidative stress， depress DEP-induced excessive autophagy flux and apoptosis signal. It means that "cardiac oxidative stress， autophagy flux and apoptosis" has the tendency to gain homeostatic balance under the action of acute endurance exercise.endprint

Keywords： acute endurance exercise； cardiac muscular tissue； diesel exhaust particles； oxidative stress； autophagy； apoptosis signal

交通相關(guān)微粒（diesel exhaust particles，DEP）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的重要致病因子，其化學(xué)成分主要有一氧化碳、碳?xì)浠衔铩⒌趸衔?、二氧化硫、多環(huán)芳烴化合物和含鉛化合物等[1-2]。大量流行病學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，急慢性DEP暴露不僅嚴(yán)重?fù)p害呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的健康，還能改變心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，增加高血壓型糖尿病、心肌梗塞和動(dòng)脈粥樣硬化等慢性疾病的發(fā)病率與死亡率[3-4]。目前，研究已充分證實(shí)，DEP本身或其攜帶的表面活性物質(zhì)促發(fā)的系統(tǒng)性氧化應(yīng)激是其損害心血管系統(tǒng)功能，進(jìn)而誘發(fā)或加重心血管疾病的重要病理機(jī)制[5-6]。

氧化應(yīng)激是細(xì)胞在遭受內(nèi)源或外源性應(yīng)激源（如大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)、電離輻射、顆粒物和DEP暴露等）強(qiáng)烈刺激時(shí)，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GPX）等內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)與丙二醛（malondialdehyde，MDA）和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）等氧化系統(tǒng)的氧化還原平衡被打破，自由基產(chǎn)生能力超過其消除能力，心肌細(xì)胞氧化損傷隨即發(fā)生[3，7-8]。DEP或其攜帶的表面活性組分可介導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而級(jí)聯(lián)性激活自噬通量信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[9]。適度的自噬通量水平可作為細(xì)胞自身的一種內(nèi)置性防御機(jī)制，清除DEP所致的氧化損傷蛋白或破損衰老細(xì)胞器，抑制細(xì)胞再度氧化損傷；但自噬的過度激活則可過多降解胞漿蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等亞細(xì)胞組件，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，甚至可能誘發(fā)自噬介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9-10]，因此，穩(wěn)定自噬通量水平可能是抑制心肌細(xì)胞凋亡，緩解DEP所致健康損害的有效手段。

耐力運(yùn)動(dòng)（包括急性耐力運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)）是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)的積極性手段。以前研究認(rèn)為，耐力運(yùn)動(dòng)可通過上調(diào)自噬水平，維持心肌、骨骼肌和肝臟等外周組織的代謝穩(wěn)態(tài)[11-12]；但也有研究[13]發(fā)現(xiàn)，耐力運(yùn)動(dòng)可在阿霉素（doxorubicin，DOX）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激致自噬過度激活時(shí)，下調(diào)自噬水平，抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。據(jù)此，耐力運(yùn)動(dòng)或許也能平衡DEP介導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬與凋亡信號(hào)的失衡狀態(tài)?；诖?，本研究建立急性DEP染毒誘導(dǎo)的急性心肌損傷模型，探討DEP對(duì)心肌氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬和凋亡信號(hào)的影響及急性耐力運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)功能與干預(yù)作用。相關(guān)研究成果將為DEP暴露下健康人和心血管疾病患者科學(xué)合理地進(jìn)行體育鍛煉提供理論支撐與參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡健康雄性C57BL/6小鼠共24只，體質(zhì)量（22±2.1） g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（Con）、急性耐力運(yùn)動(dòng)組（AE）、急性染毒組（DEP）和急性耐力運(yùn)動(dòng)+染毒組（AE+DEP），每組均6只。各組小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水飲食，飼養(yǎng)溫度20～23 ℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

DEP采集于某市區(qū)交通擁堵地段，收集在玻璃纖維濾膜，經(jīng)超聲振蕩、離心、真空干燥和稱重等系列操作后，置-20 ℃保存[3]。使用前制成0.9%生理鹽水（含Tween 80，0.01%）染毒懸液，超聲振蕩，滅菌混勻，4 ℃?zhèn)溆?。DEP組和AE+DEP組經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉（60 mg/kg），采用氣管滴注法進(jìn)行一次急性DEP染毒懸液滴注（1 mg/kg）[3]，其他組注入等劑量生理鹽水。AE組和AE+DEP組在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（10 min，10 m/min，3 d）。DEP滴注后，AE組和AE+DEP組隨即進(jìn)行一次75% ■O2max的急性耐力跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（12 m/min，90 min）[14]。

1.3 動(dòng)物處死及取材

急性耐力跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后過夜恢復(fù)12 h，斷頸椎處死，迅速摘取心臟，冰冷生理鹽水清洗，切成若干塊，凍存管分裝，迅速置液氮速凍，隨后置-80 ℃超低溫冰箱保存，待測(cè)。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

心肌組織蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法，MDA、SOD、H2O2、CAT等試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按照附帶說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，根據(jù)給定公式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和計(jì)算。

1.5 Western Blotting

冰上取心肌組織50 mg，置入裝有磁珠的研磨管中，剪碎，按質(zhì)量/體積比1∶7加入含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，放入磁珠勻漿儀，以3.55 m/s的速度勻漿3次（每次間隔時(shí)間均冰置5 min），冰上裂解20 min，14 000 g，4 ℃離心20 min，取上清，BCA法測(cè)蛋白含量，調(diào)整至統(tǒng)一濃度，95 ℃變性，分裝，-80 ℃冰箱保存。根據(jù)蛋白分子質(zhì)量大小，采用8%、10%或12%的分離膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗3～4次，每次5～10 min，用HRP標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3～4次，每次5～10 min，ECL顯影，AlphaEaseFC型凝膠成像系統(tǒng)冷光掃膜。實(shí)驗(yàn)所需抗體Atg5、LC3、P62、Beclin1、UVRAG、Caspase 3和PARP均購(gòu)自Abcam或CST公司，使用AlphaEaseFC軟件對(duì)所捕圖像進(jìn)行灰度值分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用X±S的形式表示，并使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因變量雙因素方差 （Univariate Analyses of Variance）分析，采用GraphPad Prism軟件作圖。P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為非常顯著性標(biāo)準(zhǔn)。endprint

2 結(jié)果

2.1 DEP對(duì)心肌氧化應(yīng)激的影響及急性耐力運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用

MDA和H2O2是反映心肌氧化系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)，SOD和CAT則是反映心肌抗氧化系統(tǒng)功能的關(guān)鍵指標(biāo)。通過檢測(cè)MDA和H2O2含量、SOD和CAT活性可間接衡量心肌氧化應(yīng)激水平和氧化損傷程度。DEP組心肌MDA、H2O2含量均顯著高于Con組（P<0.05；P<0.01），AE+DEP組心肌MDA、H2O2含量顯著低于DEP組（P<0.05；P<0.01），如圖1A和1C所示。DEP組心肌T-SOD活性與Con組比較雖然均呈降低態(tài)勢(shì)，但差異不具顯著性（P>0.05），AE+DEP組心肌T-SOD活性與DEP組比較亦無顯著性差異（P>0.05），如圖1B所示。DEP組心肌CAT活性顯著低于Con組（P<0.05），AE+DEP組心肌CAT活性與DEP組比較雖然呈升高態(tài)勢(shì)，但差異不具顯著性（P>0.05），如圖1D所示。結(jié)果表明：DEP可使心肌MDA和H2O2含量顯著升高，CAT活性明顯降低。急性耐力運(yùn)動(dòng)則可抑制DEP介導(dǎo)的心肌MDA和H2O2含量升高，抑制CAT活性下降，下調(diào)心肌氧化應(yīng)激水平，抑制心肌氧化損傷。

2.2 DEP對(duì)心肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及急性耐力運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用

Atg5、LC3和P62是心肌自噬進(jìn)程中的重要蛋白，可間接衡量心肌自噬通量水平。Beclin1和UVRAG是Beclin1復(fù)合物通路中的關(guān)鍵自噬蛋白，其表達(dá)情況可衡量自噬的激活是否由該通路介導(dǎo)。DEP組心肌Atg5、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率均顯著高于Con組（P<0.05；P<0.05；P<0.05），AE+DEP組心肌Atg5、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-I比率顯著低于DEP組（P<0.05，P<0.05，P<0.05），如圖2A、2B和2C所示。DEP組心肌P62蛋白表達(dá)顯著低于Con組（P<0.05），AE+DEP組心肌P62蛋白表達(dá)與DEP組比較無顯著性差異（P>0.05），如圖2D所示。DEP組心肌Beclin1、UVRAG蛋白表達(dá)與Con組比較均無顯著性差異（P>0.05），AE+DEP組心肌Beclin1、UVRAG蛋白表達(dá)與DEP組比較亦無顯著性差異（P>0.05），如圖2E和2F所示。結(jié)果表明：DEP可顯著升高心肌自噬蛋白Atg5、LC3-Ⅱ表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，降低P62蛋白表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)心肌自噬通量水平；但DEP對(duì)Beclin1通路關(guān)鍵自噬蛋白Beclin1和UVRAG表達(dá)未造成明顯影響。急性耐力運(yùn)動(dòng)可顯著抑制DEP介導(dǎo)的心肌Atg5和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增加、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率上調(diào)，抑制P62蛋白表達(dá)下降，但對(duì)Beclin1和UVRAG表達(dá)未造成明顯影響。

2.3 DEP對(duì)心肌凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及急性耐力運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用

Caspase 3和PARP是心肌凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)情況可衡量心肌細(xì)胞凋亡水平和凋亡程度。DEP組心肌Caspase 3、PARP蛋白表達(dá)顯著高于Con組（P<0.05，P<0.05），AE+DEP組Caspase 3蛋白表達(dá)與DEP組比較雖然呈下降態(tài)勢(shì)，但差異不具有顯著性（P>0.05）；AE+DEP組PARP蛋白表達(dá)顯著低于DEP組（P<0.05），如圖3A和3B所示。結(jié)果表明：DEP可促進(jìn)心肌凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase 3和PARP的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。急性耐力運(yùn)動(dòng)則可適度抑制心肌Caspase 3的蛋白表達(dá)上調(diào)，顯著降低PARP的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制DEP介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

3 分析與討論

心肌細(xì)胞中同時(shí)存在內(nèi)源性氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)。正常生理情況下，心肌抗氧化系統(tǒng)可及時(shí)清除內(nèi)源性自由基，從而維持氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，穩(wěn)定心肌氧化還原狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷信號(hào)劇烈刺激時(shí)，心肌氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)效應(yīng)失衡，胞漿自由基大量聚集，從而導(dǎo)致心肌氧化應(yīng)激損傷，并可能對(duì)心肌結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重?fù)p害。

DEP是一種嚴(yán)重威脅人類健康的重要致病因子，被認(rèn)為是顆粒物的“頭號(hào)元兇”。DEP首先在肺部沉積，并穿過肺-毛細(xì)血管屏障，進(jìn)入心血管系統(tǒng)。一方面通過影響交感-副交感神經(jīng)的平衡機(jī)能或產(chǎn)生自由基和細(xì)胞因子等物質(zhì)，導(dǎo)致心肌氧化應(yīng)激損傷；另一方面，進(jìn)入血液循環(huán)的金屬離子、自由基和有機(jī)組分等物質(zhì)也可介導(dǎo)心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)心肌結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重?fù)p害[6]。Okayama等[15]研究發(fā)現(xiàn)，DEP攜帶或產(chǎn)生的超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（·OH）等活性氧類物質(zhì)是導(dǎo)致心肌氧化損傷的關(guān)鍵病理機(jī)制，而補(bǔ)充活性氧清除劑N-（2-巰基丙?；└拾彼幔?-MPG）、抗氧化劑SOD和CAT則可降低DEP所致的心肌細(xì)胞毒性損傷。Nemmar等[3]研究發(fā)現(xiàn)：DEP滴注24 h后，心肌氧化應(yīng)激水平上升，表現(xiàn)為心肌抗氧化酶SOD活性降低；但谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性卻代償性增加。提示：心肌細(xì)胞對(duì)DEP介導(dǎo)的氧化還原失衡具有敏感的急性應(yīng)答反應(yīng)能力?？芍趸瘧?yīng)激是DEP致心肌損傷及其功能異常的重要病理機(jī)制。

本研究建立DEP介導(dǎo)的急性心肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)：DEP可使心肌MDA、H2O2含量顯著升高，CAT活性明顯降低，SOD活性亦有微量減弱。提示：DEP攜帶或產(chǎn)生的自由基、細(xì)胞因子等物質(zhì)可能造成了心肌氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)失衡，使內(nèi)源性抗氧化物不能有效清除自由基，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，甚至可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜氧化損傷。有氧耐力運(yùn)動(dòng)作為重建細(xì)胞氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡效應(yīng)的重要方式，可增強(qiáng)抗內(nèi)源性抗氧化酶活性，抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[16]。AVILA等[17]研究表明，DEP可降低肺GSH和非蛋白巰基（non-protein sulfhydryl，NPSH）水平，加劇肺氧化應(yīng)激反應(yīng)，高強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)則可上調(diào)肺CAT、GSH和NPSH水平，抑制DEP介導(dǎo)的肺氧化應(yīng)激。Vieira等[18]研究發(fā)現(xiàn)：有氧耐力運(yùn)動(dòng)可顯著降低DEP介導(dǎo)的肺氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和膠原沉積，其機(jī)制為，通過阻遏肺ROS和活性氮（RNS）釋放，抑制氧化應(yīng)激；通過抑制肺角蛋白趨化因子（keratinocyte chemoattractant，KC）、腫瘤壞死因子ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）、IL-1β和IL-6等因子的釋放，減輕炎性損傷，減少膠原沉積，抑制肺病理性改變。本研究建立75% ■O2max的急性耐力運(yùn)動(dòng)（12 m/min，90 min）恢復(fù)12 h小鼠模型，發(fā)現(xiàn)急性耐力運(yùn)動(dòng)可抑制DEP介導(dǎo)的心肌MDA和H2O2含量升高，抑制CAT活性下降，進(jìn)而促進(jìn)心肌抗氧化功能的恢復(fù)與提高，降低心肌氧化應(yīng)激水平，抑制心肌氧化損傷。endprint

DEP不僅能造成心肌氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)效應(yīng)失衡，使氧化應(yīng)激水平提高，導(dǎo)致心肌氧化損傷，還能對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡信號(hào)網(wǎng)絡(luò)造成顯著影響。細(xì)胞自噬是近期生命科學(xué)和運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域的重要研究靶點(diǎn)，禁食、能量匱乏、運(yùn)動(dòng)、顆粒物、肌肉收縮刺激和DEP等急性應(yīng)激信號(hào)均可代償性上調(diào)自噬通量水平。自噬不僅能降解胞漿中過度儲(chǔ)積的糖原、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等能源物質(zhì)，進(jìn)而有效保證細(xì)胞更新和代謝平衡所需的能量與合成底物供應(yīng)，還能降解胞漿中損傷或衰老的亞細(xì)胞組件（線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體）、病菌和ROS等代謝廢物，從而完善細(xì)胞質(zhì)量控制，抑制細(xì)胞凋亡或死亡[19-20]。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，急性DEP染毒4 h可上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）氧化應(yīng)激水平，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，并促進(jìn)鼠雙微體基因2（murine doubleminute 2，MDM2）的表達(dá)，使自噬活性增強(qiáng)，從而延緩細(xì)胞衰老。Lai等[10]研究表明，A549細(xì)胞經(jīng)DEP處理后，胞漿氧化損傷蛋白異常聚集，導(dǎo)致自噬通路激活，并通過代償性降解氧化損傷蛋白，從而抑制細(xì)胞凋亡。這說明：DEP介導(dǎo)的自噬通量水平適度上調(diào)是細(xì)胞自身的一種內(nèi)置防御機(jī)制。

但DEP介導(dǎo)的自噬通路的持續(xù)過度激活則可過多降解胞漿中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等組件，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或萎縮，甚至可能誘發(fā)自噬介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有研究表明，急性DEP染毒12 h可引起HUVEC細(xì)胞ROS和細(xì)胞因子過度釋放，使自噬水平過度增加，并級(jí)聯(lián)性增加Caspase 3/7的活性，增強(qiáng)細(xì)胞色素C（cytochrome c，Cyt C）、Bax和Bad蛋白表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，致使血管內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化[9]。這說明：過高或過低的自噬水平均不能增強(qiáng)細(xì)胞自身對(duì)DEP的防御抵抗能力，適量的自噬通量水平是抵制DEP致細(xì)胞氧化損傷效應(yīng)的最有效應(yīng)答機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，急性DEP染毒可顯著升高心肌自噬蛋白Atg5、LC3-Ⅱ表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，降低P62蛋白表達(dá)。LC3作為自噬進(jìn)程中的一種關(guān)鍵自噬蛋白，經(jīng)剪切修飾后，可變成胞漿LC3-Ⅰ，隨后酯化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，并在Atg5協(xié)助下定位于自噬體膜，參與自噬體伸展延長(zhǎng)[21]。通常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率衡量自噬活性，其比值下降說明自噬活性減弱；反之則自噬活性增強(qiáng)[22]。P62是連接自噬泡與自噬底物的橋接蛋白，在自噬過程中可與底物一并降解，其自身降解程度可間接衡量自噬降解效率[23]。本研究中自噬蛋白Atg5、LC3和P62的變化情況表明，DEP可代償性上調(diào)心肌自噬通量水平，進(jìn)而發(fā)揮其降解氧化損傷蛋白、ROS和衰老細(xì)胞器等亞細(xì)胞組件的功效。分析其可能機(jī)制是：小鼠經(jīng)一次急性DEP染毒后，DEP或其攜帶的表面活性物質(zhì)穿過肺-毛細(xì)血管屏障，進(jìn)入心血管系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。ROS作為氧化應(yīng)激的直接引物，可激活心肌AMPK/ULK1通路，誘導(dǎo)心肌自噬[24]。ROS也可阻遏PI3K/Akt/mTOR通路，抑制自噬負(fù)性調(diào)節(jié)因子mTOR，上調(diào)自噬通量水平[25]。另外，細(xì)胞大量產(chǎn)生的ROS，可將Atg4氧化失活，進(jìn)而抑制LC3-Ⅱ去脂化，保證自噬體伸展延伸，使自噬活性增強(qiáng)[26]。這或許是DEP介導(dǎo)心肌自噬水平上調(diào)的分子信號(hào)機(jī)制，但本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，DEP對(duì)Beclin1復(fù)合物通路相關(guān)自噬蛋白Beclin1和UVRAG的表達(dá)并未造成顯著影響。Beclin1是Bcl-2/Beclin1通路的關(guān)鍵自噬蛋白，可與UVRAG、Vps34和Vps15等蛋白組成復(fù)合物，促進(jìn)自噬體形成與成熟，使自噬活性增強(qiáng)[27-28]。本研究Beclin1通路蛋白表達(dá)水平無顯著性變化的原因在于，不同應(yīng)激方式對(duì)心肌自噬的調(diào)控具有特異性和選擇性，DEP誘導(dǎo)的心肌自噬可能不是由Beclin1通路控制的，其可能涉及其他調(diào)控通路（如mTOR/ULK1通路等）的參與，具體是哪條通路還有待進(jìn)一步研究，但DEP在上調(diào)自噬通量水平的同時(shí)，也顯著促進(jìn)了心肌凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3和PARP的表達(dá)。Caspase 3作為Caspase家族最重要的組員，是凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)通路的關(guān)鍵執(zhí)行者。絕大多數(shù)觸發(fā)凋亡的因素最終均要通過Caspase 3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PARP是細(xì)胞內(nèi)有效監(jiān)控DNA損傷的分子感受器，可參與DNA損傷修復(fù)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，亦是Caspase 3最重要的特異性剪切底物[29]。本研究DEP介導(dǎo)心肌Caspase 3和PARP蛋白表達(dá)上調(diào)的原因可能在于，DEP可誘發(fā)劇烈的心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致自噬通路的過度激活，進(jìn)而促發(fā)自噬介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，致使心肌氧化應(yīng)激-自噬通量-凋亡信號(hào)穩(wěn)態(tài)失衡。

有氧耐力運(yùn)動(dòng)作為穩(wěn)定細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)的積極性手段，可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、自噬通量與凋亡信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡。Smuder等[13]研究表明，耐力運(yùn)動(dòng)可抑制DOX誘導(dǎo)的自噬活性過度增強(qiáng)，減弱細(xì)胞凋亡信號(hào)，改善線粒體功能障礙、細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和肌肉流失。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，急性耐力運(yùn)動(dòng)可顯著抑制DEP介導(dǎo)的心肌Atg5和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率上調(diào)，抑制P62蛋白表達(dá)下降，并可阻止心肌Caspase 3的蛋白表達(dá)上調(diào)，顯著降低PARP的蛋白表達(dá)。其原因可能在于，急性耐力運(yùn)動(dòng)通過下調(diào)心肌氧化應(yīng)激水平，抑制心肌氧化損傷，阻止心肌自噬過度激活，抑制DEP介導(dǎo)的自噬性心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使心肌氧化應(yīng)激-自噬通量-凋亡信號(hào)向穩(wěn)態(tài)平衡的變化趨勢(shì)發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，DEP可使心肌產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，致使心肌自噬通量水平過量增加，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。急性耐力運(yùn)動(dòng)則可下調(diào)心肌氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而抑制DEP介導(dǎo)的心肌自噬過度激活和細(xì)胞凋亡。提示：急性耐力運(yùn)動(dòng)使心肌氧化應(yīng)激-自噬通量-凋亡信號(hào)具有向穩(wěn)態(tài)平衡方向發(fā)展的變化趨勢(shì)。

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