黃婭琳

（1.南京森林警察學院，南京 210023；2.國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心，南京 210023）

12S rRNA、Cyt b基因標記在幾類野生動物檢材鑒定中的差異

黃婭琳1，2

（1.南京森林警察學院，南京 210023；2.國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心，南京 210023）

【目的】通過比較線粒體DNA上的12S rRNA和Cyt b基因分子標記在幾類野生動物物種鑒定中的效果差異,以確定基因標記技術(shù)在野生動物物種鑒定中的有效性?！痉椒ā刻崛「黝愐吧鷦游飿颖綝NA，PCR擴增線粒體DNA上的12S rRNA基因片段和Cyt b基因片段，對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測及測序分析，測序結(jié)果在GenBank上進行BLAST搜索，同源性分析。并將實驗序列和NCBI上下載的與該序列存在同源性的序列用軟件MEGA 7.0進行比對并構(gòu)建進化樹?！窘Y(jié)果】從各類樣本中成功地提取到了基因組總DNA，并成功擴增出了用于動物種屬鑒定的12S rRNA基因片段、Cyt b基因片段。測序分析結(jié)果表明用12S rRNA基因片段和Cyt b基因片段均可準確鑒定黑熊、藏羚羊、鬣羚、穿山甲樣本的動物種屬，但12S rRNA基因片段無法準確鑒定北山羊樣本，BLAST搜索結(jié)果為其近緣物種山羊，而Cyt b基因片段卻可準確鑒定北山羊。各樣本基于12S rRNA、Cyt b基因序列構(gòu)建進化樹的結(jié)果與BLAST搜索結(jié)果相符?！窘Y(jié)論】單一位點基因標記能夠準確鑒別親緣關(guān)系較遠的物種。但對某些近緣物種，單一位點基因標記的鑒別能力較差，故野生動物物種鑒定宜選用2個以上的基因標記位點。

野生動物；種屬鑒定；12S rRNA；Cyt b；基因標記

隨著非法獵殺、販賣野生動物案件的與日俱增，越來越多的野生動物物種面臨滅絕的危險?？焖?、準確地鑒定其種屬將有助于準確量刑，打擊犯罪，保護瀕危的野生動物資源。案件中常常涉及小塊肌肉組織、血痕、毛發(fā)等微量檢材或炮制加工過的動物藥材，針對此類動物物證，目前往往通過線粒體DNA（mtDNA）保守片段測序技術(shù)準確確定動物物種。線粒體DNA由于其結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、在世代傳遞中沒有基因重組等優(yōu)點，常常被用作動物種屬鑒定的工具。文獻報道可用于物種鑒定的基因標記位點有 16S rRNA、12S rRNA、Cyt b、D-loop基因片段等。其中，Cyt b基因片段、12S rRNA基因片段是最常用于動物物種鑒定的基因片段[1]。王義權(quán)等報道了用DNA序列分析方法通過Cyt b基因片段序列來鑒定中藥材烏梢蛇及其偽品[2]。吳平等通過對中華鱉、山瑞鱉以及一些龜類的12S rRNA基因片段的測序，通過對待檢樣品12S rRNA基因片段的序列分析，從數(shù)據(jù)庫中判斷待檢樣品是否為正品[3]。迄今，已有大量研究通過測定物種的12S rRNA序列或Cyt b序列，然后向GenBank中搜索類似序列并對序列進行分析以確定物種[4-10]。采用此方法成功鑒定了黑麂、黃麂、黑熊、穿山甲、非洲彎角羚、非洲跳羚、非洲黑斑羚、非洲象、孔雀、孟加拉巨蜥以及各種家畜家禽，為海關(guān)進出口監(jiān)管和重點保護野生動物的執(zhí)法工作提供了重要幫助[11]。

直接測序法用于物種的鑒定可操作性強，結(jié)合了PCR技術(shù)可用于毛發(fā)、血痕、唾液等微量物證，對于未知物種只需用通用引物擴增后測序就可獲得相應(yīng)的基因片段。但在日常案件的鑒定中，由于時間和經(jīng)費的限制，通常是將單一基因位點分子標記用于物種鑒定。但單一基因位點分子標記是否適用于各類野生動物以及案件中所涉及到的各種狀態(tài)的樣本，本研究擬通過比較12S rRNA和Cyt b基因位點分子標記在檢測幾類常見涉案野生動物樣本中的效果差異來進行探究。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料均來自國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心日常檢案，檢材物種（已知）及狀態(tài)如表1所示，檢材圖片如圖1所示。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA的提取

針對不同的樣本采用不同的取樣方法，肌肉組織剪取約20 mg置于1.5 mL EP管中，骨骼、動物角、甲片均用銼子磨取約30 mg置1.5 mL EP管中，毛發(fā)剪取約3～5 cm、血痕剪取約0.5 cm2置1.5 mL EP管中。血痕樣本DNA采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根公司）提取，其他樣本的基因組總DNA均用DNA提取試劑盒（Takara公司）提取，提取方法參照試劑盒說明書，骨骼、動物角、甲片、毛發(fā)的組織消化時間延長為25～30 h。用分光光度法檢測樣本DNA的純度和濃度。將樣品總DNA置于-20℃保存，待后續(xù)試驗用。

表1 樣本物種及狀態(tài)Table 1 Species and status of samples

圖1 實驗樣本Figure 1 Experimental samples

1.2.2 PCR擴增

擴增線粒體DNA上12S rRNA基因片段采用通用引物：L1091和H1478[12]，擴增線粒體DNA上Cyt b基因片段采用自設(shè)計引物，利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計。引物序列如下：

擴增反應(yīng)在Veriti PCR儀（AB公司）上進行。12S rRNA基因片段和Cyt b基因片段均采用相同反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為25 μL，其中含2.5 pmol/μL引物各 2 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，1.25 U Ex Taq 酶0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mM MgCl21.5 μL，10～20 ng/μL 模板 1～2 μL，其他為滅菌蒸餾水。PCR 反應(yīng)所需試劑及引物均購自Takara公司。PCR反應(yīng)程序：94℃預變性 3 min；94℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 1 min，38個循環(huán)；72℃延伸 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)（GENEGENUS）上檢測、成像。

1.2.3 PCR擴增片段測序

PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物（小量）純化試劑盒（Takara公司）純化。以純化產(chǎn)物為模板DNA，用ABI公司測序試劑盒進行測序PCR擴增（操作按試劑盒說明），擴增產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺變性后，ABI公司3130xl測序儀測序。

1.2.4 BLAST搜索及序列對比

將測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST搜索，并進行同源性分析比對，以確定動物種屬，用DNAMAN生物學軟件進行同源性分析。

1.2.5 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

在GenBank下載與本研究涉及的5個物種存在同源性的序列，保證每個物種至少有兩個來自不同實驗室的序列，同時盡可能下載完所有的近源物種序列。1號樣本近緣物種12S rRNA基因片段序列信息如表2所示，其他樣本近緣物種序列略。通過軟件MEGA 7.0進行序列比對和進化樹構(gòu)建。去除與樣本序列相對應(yīng)以外的區(qū)段后，將序列比對文件保存為CLUSTER格式。其后，將該CLUSTER文件導入MEGA 7.0軟件，將其轉(zhuǎn)化為Meg文件后進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。統(tǒng)計分析采用鄰接（Neighbor Joining，NJ）方法，進化距離的計算采用Kimura 2-Parameter模型，步差值（bootstrap）設(shè)置為 1 000。

表2 GenBank來源序列信息Table 2 Sequence information downloaded from GenBank

2 結(jié)果

2.1 電泳檢測結(jié)果及分析

分光光度法測得1號至6號樣本基因組總DNA 的 OD260/OD280 分 別 為 1.67、1.23、1.82、1.75、1.65、1.25，表明各樣本DNA純度較高。樣本總DNA 濃度為 15 ng/μL、2 ng/μL、18 ng/μL、15 ng/μL、17 ng/μL、3 ng/μL。

圖2所示為1號至6號樣本基因組總DNA電泳結(jié)果，由圖可見，1號、3號、4號、5號樣本DNA裂解液中檢測到基因組總DNA（箭頭所示），表明該樣品中提取到的總DNA質(zhì)量較高。但電泳檢測未檢測到2號、6號樣本DNA裂解液中的基因組總DNA，推測這是由于2號、6號樣本DNA含量過低的原因。

圖2 樣本基因組總DNA瓊脂糖電泳圖Figure 2 Electropherogram of genome total DNA

以所檢動物樣本基因組總DNA為模板，擴增線粒體DNA上12S rRNA和Cyt b基因片段，結(jié)果如圖3所示。由圖可見，檢材DNA通過PCR擴增，1～6號樣本在 12S rRNA（約 430 bp）和 Cyt b（約 360 bp）目的基因片段處均得到了大量的PCR產(chǎn)物（箭頭所示），其中2號毛發(fā)樣本和6號炮制過的穿山甲片樣本雖然基因組總DNA含量較低，但通過PCR擴增均獲得了大量的擴增產(chǎn)物。

圖3 12S rRNA和Cyt b基因片段PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜Figure 3 Electropherogram of PCR products of 12S rRNA gene and Cyt b gene

2.2 基因序列比對

將PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)3130xl測序儀進行測序，各樣本測序所得序列經(jīng)BLAST搜索，同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)所檢測的1～6號樣本的Cyt b基因片段序列分別與黑熊、藏羚羊、北山羊、鬣羚、穿山甲線粒體DNA Cyt b基因序列的部分片段的同源性均高達99%至100%，均能準確鑒定樣本所屬物種。而1～6號樣本的12S rRNA基因片段序列與黑熊、藏羚羊、山羊、鬣羚、穿山甲線粒體DNA 12S rRNA基因序列的部分片段的同源性均高達99%至100%，表明本研究所用12S rRNA基因片段能準確鑒定1號、2號、4號、5號、6號樣本的所屬物種，但不能準確鑒定3號樣本北山羊肌肉組織的種屬。

結(jié)果表明，12S rRNA基因序列和Cyt b基因序列在黑熊、藏羚羊、鬣羚、穿山甲的鑒定中都可得出相同的結(jié)果，能準確確定其所屬物種。而在北山羊的鑒定中，本研究所擴增的Cyt b基因片段，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的北山羊的Cyt b基因序列同源性達99%，通過DNAMAN生物學軟件分析，發(fā)現(xiàn)該序列與已有的山羊的Cyt b基因序列同源性達95%，表明本研究擴增的Cyt b基因片段能區(qū)分出山羊和北山羊；而本研究所擴增的12SrRNA基因片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊的同源性最高，達99%，DNAMAN生物學軟件分析結(jié)果與之相符，表明本研究所擴增的12S rRNA基因片段不能區(qū)分山羊和北山羊這兩個近緣物種。

2.3 采用系統(tǒng)進化樹驗證基因序列比對結(jié)果

基于12S rRNA序列構(gòu)建的1號樣本及熊科近源物種的系統(tǒng)進化樹如圖4所示，結(jié)果表明1號樣本（Sample 1）在熊科Ursidae的5個屬、8個種中與亞洲黑熊Ursus thibetanus來源個體距離最近，被聚為一支?；贙2P模型計算進化距離，1號樣本的12S rRNA序列與亞洲黑熊的分支長度最小，介于0～0.005之間；與大熊貓 Ailuropoda melanoleuca進化距離最遠，分支長度達0.076 6。因此，1號樣本被判斷為來自亞洲黑熊，這與BLAST搜索結(jié)果相符。采用相同的方法構(gòu)建2號～6號樣本的系統(tǒng)進化樹，聚類結(jié)果均與BLAST搜索結(jié)果一致。

3 討論

在樣本的選擇上，本研究選用了骨骼、毛發(fā)、肌肉組織、血痕、角制品、已炮制過的穿山甲甲片等野生動物案件中常常遇到的，具有代表性的檢材樣本。不同檢材由于DNA含量的差異，其DNA提取的難易程度不同。血痕、肌肉組織是野生動物案件中最常見的檢材，由于其DNA含量大，片段長度較長，DNA提取及PCR擴增的難度較小，鑒定成功率較高。而本研究所選用的骨骼、毛發(fā)、角制品、已炮制過的穿山甲甲片均為較為陳舊的檢材，由于角質(zhì)化程度較高或經(jīng)過人為加工，其DNA含量較低或已大量降解，其中毛發(fā)和炮制過的甲片DNA含量極低，其DNA提取液的濃度未達到瓊脂糖電泳檢測的要求，電泳檢測未見清晰條帶（見圖2）。

圖4 基于12S rRNA序列構(gòu)建的1號樣本（Sample 1）及熊科近源物種的系統(tǒng)進化樹Figure 4 Phylogenetic tree based on 12S rRNA sequences from sample 1 and its homologous species in bear family

野生動物案件涉及的檢材常常是降解、陳舊、高度角質(zhì)化、炮制加工過的動物檢材，通過細胞核DNA是無法提取到符合鑒定需求的長度的DNA片段，通常高于200 bp以上的片段就無法擴增出來，而線粒體DNA具有環(huán)狀雙鏈的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、在細胞中拷貝數(shù)多等優(yōu)點，非常適合降解、陳舊檢材的鑒定。本研究表明降解、陳舊、高度角質(zhì)化、炮制加工過的動物檢材中仍能提取到符合較長片段（如400～500 bp）PCR擴增需求的模板DNA。

在基因位點的選擇上，本研究選用了線粒體DNA上的12S rRNA和Cyt b基因位點，由于線粒體12S rRNA基因的進化速率較快，不同物種間序列差異大，有利于設(shè)計針對目標物種的高特異性引物，且擴增該基因的穩(wěn)定性和可重復性好。而Cyt b基因是動物線粒體上一個編碼蛋白質(zhì)的基因，有一定的保守性，根據(jù)蛇類藥材Cyt b基因片段序列的分析[2]，表明12S rRNA和Cyt b基因這類在種內(nèi)個體間的序列差異很小，而種間的序列差異卻較大的DNA片段，正是物種鑒別的理想標記。此外，NCBI的GenBank中有大量的12S rRNA基因、Cyt b基因片段比對序列資源，為案件中未知物種的鑒定提供了極大的方便。近年來，12S rRNA基因片段和Cyt b基因片段已被廣泛用于野生動物刑事物證鑒定和動物類藥材的鑒定研究。雖然大量研究表明單一的12S rRNA基因位點或Cyt b基因位點在大多數(shù)動物上均能得到準確的鑒定結(jié)果，但本研究表明單一基因位點分子標記對于一些親緣關(guān)系很近的動物物種鑒別能力較差，如12S rRNA基因位點用于山羊和國家一級重點保護動物北山羊的鑒定，這也可能是由于本研究是選用的12S rRNA基因的通用引物，鑒定的特異性稍差的緣故,在后續(xù)的研究中將設(shè)計特異性引物進一步研究。因此，在野生動物未知物種的鑒定中宜同時選用2個以上的基因標記位點，以提高鑒定的準確性。此外，COI也是目前廣泛應(yīng)用的線粒體分子標記，常用于昆蟲及野生動物物種的種屬鑒定，尤其是在動物類中藥材基原動物的種屬鑒定及其混偽品的鑒定中應(yīng)用極為廣泛[13-19]。根據(jù)2009年以“生命條形碼與人類未來”為主題的中國科協(xié)第31期新觀點新學說學術(shù)沙龍的報道，COI條形碼具有很高的物種鑒定可靠性，但同時也有部分研究證實COI并不適用于所有的動物類群，還需要一個輔助性的條形碼序列。本課題組曾經(jīng)在45種野生動物樣本上做過比較，發(fā)現(xiàn)COI與本文所用的12S rRNA、Cyt b在鑒定的準確性方面差別不大。在所檢測的大多數(shù)動物上，這3個基因位點均能準確鑒定物種，但在個別的物種上它們存在差異，此外，對于不同的檢材COI與12S rRNA、Cyt b擴增成功的能力存在一定差異，文獻中COI基因的通用引物擴增片段是580 bp以上的片段，作者研究發(fā)現(xiàn)對于某些陳舊、DNA有所降解的檢材，其PCR擴增的成功率有所下降，相對來說，本研究擴增的12S rRNA、Cyt b基因片段均為400 bp左右的片段，陳舊的或高溫處理過的檢材均能成功擴增出目的片段[20]。

大量研究表明，核基因組中存在大量的線粒體假基因[21-22]。由于本文設(shè)計的引物是根據(jù)高度保守的區(qū)域設(shè)計引物，所以很可能會導致線粒體DNA正?；蚝秃思倩蚬矓U增。但假基因有一個重要來源是以mRNA為中介的正?；虻拈g接復制品：即在真核生物細胞中的mRNA先經(jīng)反向轉(zhuǎn)錄形成DNA，再整合到染色體上而形成的。因此，核基因組假基因中沒有正?；蛑写嬖诘膬?nèi)含子；3’末端有Poly A結(jié)構(gòu)；有些假基因與相應(yīng)的正?；蛎艽a子偏好不同。Cai等使用通用引物對來自總DNA的COI擴增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)，具有核DNA污染的個體，測序峰圖具有很多雙峰現(xiàn)象；而只來自線粒體DNA的樣品沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象[23]。鑒于線粒體DNA正?；蚝秃思倩虼嬖诘囊陨闲蛄刑卣鞑町悾狙芯客ㄟ^對實際擴增產(chǎn)物峰圖和序列的分析，排除了本研究擴增所得序列是受核基因組假基因干擾的可能性，進一步增強了本文研究結(jié)果的可靠性。

通過利用所獲得的序列進行BLAST在NCBI上進行同源搜索鑒定物種的方法已被廣泛應(yīng)用。但這種方法的科學性有待商榷。這是因為NCBI上的序列的真實性、可靠性都有待驗證；測序得到的序列頭尾兩端準確性不高，網(wǎng)上BLAST比對前沒有去除。一個替代方法可以是通過將NCBI上所有的與該序列存在同源性的序列都下載下來，盡量保證每個物種至少有兩個來自不同實驗室的序列，同時盡可能下載完所有的近源物種序列。利用CLUSTER對比后，裁剪去除與樣品核心序列相對應(yīng)以外的區(qū)段，然后構(gòu)建進化樹，根據(jù)進化樹來判斷待檢樣品屬于哪個物種。本研究的結(jié)果表明，這兩種方法所得結(jié)果具有高度的一致性。相對來講，BLAST法簡單快速；而進化樹分析方法科學性更強，因此兩者可以相互驗證補充。

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The Differences of 12S rRNA and Cyt b Gene Marker in Several Wildlife Species Identification

HUANG Ya-lin1，2
（1.Nanjing Forest Police College，Nanjing 210023，China；2.Wildlife Material Evidence Appraisal Center of the State Forestry Administration，Nanjing 210023，China)

【Objective】To study the effectiveness of gene markers for wildlife species identification，we compared the differences between mtDNA 12S rRNA and Cyt b gene markers in wildlife species identification.【Method】The isolation of DNA from wildlife samples was carried out.Partial mitochondrion DNA 12S rRNA and Cyt b genes were amplified and sequenced.The original animal identifications of different wildlife samples were determined by BLAST search of the sequences in GenBank.Then，genetic distance and phylogenetic tree were analyzed by MEGA 7.0.【Result】The genome DNAs were successfully extracted from wildlife samples and partial mitochondrion DNA 12S rRNA and Cyt b genes were amplified.For the identification of Ursus thibetanus，Pantholops hodgsonii，Capricornis milneedwardsii，and Manis javanica sample species，both the 12S rRNA gene marker and Cyt b gene marker can identify the wild species successfully.However，in terms of identification of Capra ibex，Cyt b gene marker could distinguish Capra ibex from Capra hircus gene sequences，while 12S rRNA gene marker not.Phylogenetic tree constructed based on 12S rRNA and Cyt b sequences was consistent with BLAST analysis.【Conclusion】Most of wild animals can be identified by single locus marker.When comes to some closely relative species，the identification ability of single locus marker is poor，thus two or more gene marker loci are recommended to identify wild animal species.

wild animal；species identification；12S rRNA；Cyt b；gene marker

Q959 文獻標志碼：A 文章編號：1000-2650（2017）02-0273-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.02.021

2016-12-02

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（LGYB201518）資助。

黃婭琳，博士，副教授，主要從事野生動物DNA鑒定及相關(guān)遺傳學研究，E-mail：huangyalin228@163.com。

（本文審稿：徐懷亮；責任編輯：秦碧雯；英文審稿：劉益平）