張小燕，劉志香，廖保生，肖水明，徐 江＊＊，盛 瑋

（1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 淮北 235000；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

本草基因組學(xué)（herbgenomics）是利用組學(xué)技術(shù)研究中藥基原物種的遺傳信息及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明中藥防治人類疾病分子機(jī)制的學(xué)科，從基因組水平研究中藥及其對人體作用的前沿科學(xué)[1,2]。人參作為我國傳統(tǒng)名貴藥材，享有“百草之王”美譽(yù)。人參具有48條染色體（2n=4x=48）[3]，由于基因組數(shù)據(jù)的缺乏嚴(yán)重制約了人參基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)的開展。評價(jià)人參基因組的大小及復(fù)雜程度，將有助于確定適合人參全基因組測序的研究策略。目前多種方法可用于測定基因組大小，如物理圖譜法[4]、流式細(xì)胞術(shù)[5-7]和高通量測序技術(shù)[8,9]。流式細(xì)胞術(shù)是基因組預(yù)估常用的方法[10]，可檢測單細(xì)胞倍性以及細(xì)胞核DNA含量[11,12]，具有特異性好，靈敏度高，同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)檢測等優(yōu)點(diǎn)。新一代測序技術(shù)的迅速發(fā)展使其成為測定基因組大小的重要方法，具有通量高、速度快、單次運(yùn)行能產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn)。

本研究聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)和高通量測序技術(shù)對人參基因組進(jìn)行測定和評估，并把這兩種技術(shù)的測定結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證，旨在為人參全基因組測序方案的制定提供依據(jù)，為人參本草基因組學(xué)[1,2]的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

人參（Panax ginsengC.A.Mey）（實(shí)驗(yàn)基地栽培株系IR826）；大豆（Glycine max(L.)Merrill）；粳稻（Oryza sativassp.Nipponbare）。

Accuri C6型流式細(xì)胞儀（美國BD公司），1-14K低溫冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；RXZ型智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Illumina Hiseq X Ten（美國Illumina公司）；Agilent Technologies 2100生物分析儀（美國 Agilent公司）；Covaris M220 Focusedultrasonicator（美國Covaris公司）。

吐溫-20（Sigma-Aldrich,cat.No.SZBD2190V）；碘化丙啶（BD Biosciences Pharmingen,cat.No.550825）；RNaseA（TIANGEN,cat.No.K20822）；Quick-Load 1kb Extend DNA Ladder（BioLabs,cat.No.0041602）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 材料培養(yǎng)

水稻、大豆材料培養(yǎng)：選取飽滿成熟完整的水稻和大豆種子，用去離子水沖洗種子3-5次，并浸泡過夜，將種子放在浸濕的有孔濾膜上，置于燒杯中室溫條件下培養(yǎng)一周。

人參愈傷組織培養(yǎng)：切取人參幼嫩的葉片置于含有植物激素的MS培養(yǎng)基（1 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸，0.1 mg·L-1激動素）上，于12 h黑暗、12 h光照的20±2℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞核懸液制備與染色

水稻與大豆均取其幼嫩的葉各兩份，每份質(zhì)量100 mg，人參取其愈傷組織各兩份，每份質(zhì)量200 mg，將其置于冰浴的培養(yǎng)皿中，吸取2 mL Otto I緩沖液（0.1 mol·L-1檸檬酸，0.5%（v/v）吐溫-20，pH 2.0-3.0），用鋒利刀片迅速將葉片、愈傷組織切碎；用移液器反復(fù)吹打使其與緩沖液混合均勻，經(jīng)40μm尼龍篩網(wǎng)(Corning,cat.No.352340)過濾，濾液置入2 mL的離心管，于4℃離心機(jī)中以5000 r·min-1離心3 min去除上清，加入1 mL預(yù)冷的Otto I緩沖液，重懸后，2600 r·min-1離心30 s，去上清，加入1 mL預(yù)冷的Otto I緩沖液，再次2600 r·min-1離心30 s去上清，加入900 μL的Otto I緩沖液，輕搖混勻，置于冰上待用。上機(jī)檢測前加入600 μL的Otto II緩沖液（0.4 mol·L-1磷酸二氫鈉，pH 8.0-9.0），加等體積的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料，避光染色15 min。

2.3 流式細(xì)胞儀測定基因組大小

經(jīng)PI染色的樣品，在高速液流下受到激光照射，發(fā)射產(chǎn)生熒光信號，其熒光信號的強(qiáng)弱與DNA含量成正比，可用于估測生物基因組大小。本實(shí)驗(yàn)選取水稻和大豆為內(nèi)參，根據(jù)公式：樣品基因組大小=（樣品平均峰值/內(nèi)參平均峰值）×內(nèi)參基因組大小，獲得待測樣品的基因組大小。再根據(jù)1 pg=0.978×109bp[13]計(jì)算得到待測樣品的相對DNA含量。

2.4 人參基因組DNA提取及檢測

取人參愈傷組織，采用CTAB法提取人參基因組DNA，Qubit 2.0檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組完整性，檢測參數(shù)為膠濃度0.8%，電壓為120 V，電泳時(shí)間為30 min，選用1 kb Extend DNA Ladder作為參照。

2.5 測序

對符合質(zhì)量要求的DNA樣品構(gòu)建shotgun文庫，首先基因組DNA片段化成約250-500 bp的片段，在片段兩端連接接頭序列，篩選去除接頭序列自連片段，而后采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段的長度篩選，氫氧化鈉變性產(chǎn)生單鏈DNA片段，進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增。最后用Illumina Hiseq X Ten平臺進(jìn)行雙末端PE 150測序，通過Skewer軟件（Version 0.2.2）過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)用于后續(xù)的基因組大小、雜合度以及GC含量分析。

2.6 K-mer分析

本實(shí)驗(yàn)采用基于K-mer的分析方法估計(jì)人參基因組大小和雜合率，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行17-mer分析。假設(shè)從reads中逐堿基取出所有K-mer能夠遍歷整個(gè)基因組，且K-mer頻次分布服從泊松分布，即可從所有測序reads中逐堿基取K-mer，統(tǒng)計(jì)K-mer頻數(shù)分布，然后以K-mer及其出現(xiàn)的次數(shù)為橫坐標(biāo)，以出現(xiàn)次數(shù)的片段總數(shù)占總片段的百分比為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算獲得K-mer深度估計(jì)值，用于估計(jì)基因組大小。

2.7 雜合率估計(jì)

本研究選用模式生物擬南芥基因組序列進(jìn)行人參基因組雜合率評估。分別加入雜合率為1%，0.5%和0.1%的模擬數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，將所得模擬數(shù)據(jù)分別進(jìn)行17-mer分析。通過所測物種真實(shí)曲線的主峰和雜合峰與模擬數(shù)據(jù)線的對比，可判斷所測物種雜合率水平與最接近的模擬數(shù)據(jù)相近。

3 結(jié)果

3.1 基于流式細(xì)胞術(shù)人參基因組大小分析

首先對水稻，大豆和人參進(jìn)行單獨(dú)測定，比較分析了待測樣品水稻與大豆、大豆與人參、水稻大豆與人參測定的結(jié)果，確定了水稻、大豆與人參的基因組測定峰無重疊，保證了選取水稻和大豆作為內(nèi)參的可靠性，可用于預(yù)測基因組大小（圖1）。由表1可以看出，通過比較其峰均值，大豆基因組為水稻的2.25倍，由此預(yù)估得到大豆的基因組大小為0.89±0.02 Gb，其DNA相對含量為1.82±0.03 pg；人參基因組大小是大豆的3.71倍（表2），因此可得人參基因組大小為3.32±0.02 Gb，其DNA相對含量為6.79±0.05 pg。另外，水稻、大豆和人參峰均值進(jìn)行比較，大豆基因組大小是水稻的2.40倍，人參是大豆的3.58倍（表3），由此可估測大豆基因組大小為0.95±0.01 Gb，相對DNA含量為1.95±0.02 pg，人參基因組大小為3.42±0.02 Gb，相對DNA含量為6.98±0.05 pg。

圖1 水稻、大豆，人參流式細(xì)胞儀測定結(jié)果

表1 流式細(xì)胞儀測定的樣品（大豆）和內(nèi)參（水稻）峰均值

表2 流式細(xì)胞儀測定的樣品（人參）和內(nèi)參（大豆）峰均值

表3 流式細(xì)胞儀測定的樣品（大豆，人參）和內(nèi)參（水稻）峰均值

3.2 基于高通量測序預(yù)測人參基因組大小

3.2.1 測序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)

如表4所示，經(jīng)高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)為191.41 Gb，按照流式細(xì)胞所得人參基因組大小為3.42 Gb計(jì)算測序深度為55.97 X。過濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，得到的總數(shù)據(jù)量為183.82 Gb，測序深度為53.75 X。

3.2.2 17-mer分析和基因組大小預(yù)測

使用人參基因組過濾后有183.82 Gb的數(shù)據(jù)用于17-mer分析，Reads形成17-mer頻率深度分布圖，如圖2。橫、縱坐標(biāo)分別表示17-mer出現(xiàn)的次數(shù)和出現(xiàn)的頻率。圖中在49 X深度和100 X深度位置分別有一個(gè)峰，其中49 X的位置為主峰，即基因組正常期望深度，100 X位置為重復(fù)峰位置。從表5可以看出，K-mer的總數(shù)為163927.97，可以通過公式：基因組大小=K-mer的總數(shù)/K-mer的期望深度，計(jì)算得到的人參基因組大小為3.35 Gb。

3.2.3 雜合率估計(jì)

選用擬南芥基因組作為訓(xùn)練序列集，模擬1%，0.5%和0.1%雜合程度情況下17-mer的分布曲線，從而對人參的雜合度進(jìn)行定性評估。由圖3研究結(jié)果可知，人參的雜合度與雜合度為0.1%的擬南芥模擬數(shù)據(jù)最接近，因此，可以認(rèn)為人參的雜合率處于0.1%左右，其基因組雜合度較低。

4 討論

流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用較多的基因組預(yù)測方法，已被成功的應(yīng)用于五節(jié)芒[7]、毛竹[14]、山櫻花[15]等植物的基因組大小研究上，在樣品處理上，要求被檢測的植物樣本必須是完整的單細(xì)胞或細(xì)胞核懸液，因此，實(shí)驗(yàn)操作中取材上優(yōu)先選取新鮮葉片或幼嫩葉片，置于冰上并充分切碎。高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展使其成為基因組評估的重要手段，利用K-mer分析的方法對基因組進(jìn)行預(yù)估，其操作較為簡單，而且獲得除基因組外更多的物種信息，如物種的雜合率、重復(fù)序列、GC含量等[16]。然而，流式細(xì)胞儀在檢測植物樣品時(shí)由于植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)及次生代謝產(chǎn)物的影響，會對檢測結(jié)果造成一定的干擾[17]。高通量測序技術(shù)用于預(yù)測植物基因組大小，克服了內(nèi)源性物質(zhì)對植物基因組大小評估的影響[16,18]。因此對植物基因組大小的預(yù)測選取流式細(xì)胞術(shù)和K-mer分析相結(jié)合，以期獲得更好的結(jié)果。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)和K-mer分析的方法得到人參基因組大小分別為3.42 Gb和3.35 Gb。基因組雜合度評估顯示人參基因組有較低的雜合度，雜合率約為0.1%；但重復(fù)序列較高，因此對人參進(jìn)行全基因組組裝，可使用BAC-by-BAC策略以及構(gòu)建大片段文庫，跨越重復(fù)區(qū)。本研究結(jié)果有助于人參全基因組的de novo組裝和功能基因注釋等本草基因組學(xué)的研究。

表4 人參基因組數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)

圖2 17-mer分布曲線

圖3 17-mer雜合率估計(jì)圖

表5 17-mer分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

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