鄭化軍，王賢和，柯昌斌，李 莉

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 十堰 442000；2.十堰市太和醫(yī)院十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 十堰 442000）

P53為編碼53的蛋白，是最常見(jiàn)抑癌基因之一[1]。P53參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，在一定程度上維持基因的穩(wěn)定性，防止腫瘤細(xì)胞突變轉(zhuǎn)移。P53高表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[2]。P16基因也是一種抑癌基因，參與調(diào)控細(xì)胞分化與增殖[3]。P53和P16直接或間接地參與細(xì)胞周期調(diào)控，這種負(fù)調(diào)控可抑制細(xì)胞無(wú)限分化與增殖，因此，任何引起P53和P16基因突變的因素均會(huì)引起細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避這種負(fù)性調(diào)控，細(xì)胞出現(xiàn)無(wú)緒分化與增殖而引發(fā)惡性腫瘤[4]。因此，糾正P53和P16基因過(guò)度表達(dá)可使細(xì)胞增殖與調(diào)亡周期維持在正常范圍內(nèi)，降低腫瘤的發(fā)生概率。青藤堿是目前已知的抗癌中草藥之一，其主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞G1-S期，對(duì)乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的分化增殖均有肯定的抑制作用[5]。目前青藤堿對(duì)肺癌的治療機(jī)制鮮有實(shí)驗(yàn)報(bào)告，其對(duì)肺癌極具研究?jī)r(jià)值，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察其對(duì)WALKER-256移植性肺癌大鼠抑癌基因P53和P16及其基因表達(dá)的影響，研究其治療機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑

青藤堿（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：017020293）；大鼠Walker癌肉瘤256瘤株購(gòu)自上海鑫閔生命科學(xué)有限公司；鼠P16、P53ELISA試劑盒均購(gòu)自上海雙贏生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠（上海前塵生物科技有限公司，批號(hào)：354230）；注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：0170123012）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，體重160±10 g，免疫缺陷的雄性BALB/c-nu/nu2裸小鼠4只，體重20±2 g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證（SCXK（鄂）2017-0008），設(shè)施許可證號(hào)（SYXK（鄂）2017-0031）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 瘤源處理

取出儲(chǔ)存Walker癌肉瘤256瘤株的冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其全部融化，直接倒入含有10 mL新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)角瓶復(fù)蘇24 h，去除溶質(zhì)二甲基亞砜（Dimeth?yl Sulfoxide，DMSO），然后注入離心管低速1000 r?s-1離心，5 min，棄上清液，取底部Walker-256癌細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成1×107mL-1的混懸液，注射到BALB/c-nu/nu2裸小鼠腹腔（0.2 mL/只），一周后抽取BALB/c-nu/nu2裸小鼠腹水，作為瘤源置于4℃冷凍管保存?zhèn)溆肹6]。

2.2 建立Walker-256移植性肺癌模型方法

參照文獻(xiàn)[7]，將儲(chǔ)存的Walker癌肉瘤256瘤株小鼠腹水，先用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，然后再用生理鹽水稀釋成1.5×106mL-1癌細(xì)胞混懸液備用。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，碘伏消毒大鼠左胸皮膚，將1.5×106mL-1的WALKER-256細(xì)胞懸液與等體積的Matrigel基質(zhì)膠在冰面上混勻，用10注射器抽取以上混合液，于左肺5-6肋間注射0.5 mL（進(jìn)針深度約0.6 cm），停針10 s后緩慢拔出針管，3周后可得Walker移植性肺癌模型。注射建模后單籠飼養(yǎng)，自然光照，自由飲水和攝食，動(dòng)物房恒溫在20-22℃，恒濕60%-70%。本方法制備簡(jiǎn)單、對(duì)大鼠損傷小、腫瘤病灶部位明確、單一、成瘤率高，且動(dòng)物死亡率低。本實(shí)驗(yàn)在注射瘤源3周后，死亡大鼠7只，經(jīng)影像學(xué)拍片檢查，成瘤大鼠30只，成腫瘤率為75%。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

挑選成瘤SD大鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)后隨機(jī)分為模型組、環(huán)磷酰胺組、青藤堿治療組（n=10），另取10只健康SD大鼠設(shè)為正常對(duì)照組。青藤堿治療組按100 mg?kg-1?d的劑量背部皮下注射10%青藤堿，正常對(duì)照組和模型組按1 mL?kg-1?d劑量注射生理鹽水，環(huán)磷酰胺組按5 mg·kg-1·d的劑量注射作為陽(yáng)性對(duì)照。4組均按1次/日，連續(xù)給藥10周。

表1 P53，P16及β-actin引物序列表及其擴(kuò)增產(chǎn)物大小

2.4 Walker-256移植性肺癌抑瘤率檢測(cè)及細(xì)胞周期比值檢測(cè)

于最后一次給藥后，處死大鼠，摘取左肺瘤體，分離包膜，稱重，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測(cè)量瘤體長(zhǎng)、短徑各3次，取均其均值計(jì)算瘤體積。瘤體積=ax6/2，a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為腫瘤短徑。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-青藤堿治療組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。將分離好的瘤體用生理鹽水沖洗干凈，編號(hào)，-4℃冷藏備檢。檢測(cè)時(shí)將腫瘤組織勻漿，采用美國(guó)Epics Altra流式細(xì)胞儀檢測(cè)WALKER-256癌細(xì)胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例。

2.5 免疫組化法檢測(cè)P53和P16

采用免疫組化法檢測(cè)瘤體P53和P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率，P53和P16蛋白陽(yáng)性為染色后棕黃色或黃褐色，檢測(cè)時(shí)在高倍鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算P53和P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。

2.6 RT-PCR方法檢測(cè)瘤體P53，P16 mRNA表達(dá)

取瘤體組織50 mg，一步法提取瘤體組織總RNA，取1 μg總RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)P53和P16mRNA表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、Taq酶（5 u·μL-1）0.45 μL、dNTPs（10 mmo1 ?L-1）1 μL、含 15 mmol/LMg2+緩沖液5 μL，β-actin的上、下游引物各1 μL，P53和P16上、下游引物各1 μL，用滅菌水補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：93℃，30 s；94℃，3 min；64℃，30 s；71℃，1 min；35個(gè)循環(huán)，71℃，7 min。以目的基因灰度值/β-actin灰度值之比值表示P53、P16mRNA的相對(duì)值[8]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)，先對(duì)各組進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間差異則采用兩樣本均數(shù)Dunnet-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 青藤堿對(duì)肺癌模型大鼠瘤體形態(tài)及抑瘤率的影響

青藤堿組瘤質(zhì)量、瘤體積均低于模型組，抑瘤率高于模型組，與模型組比較，P＜0.05，與正常對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2 青藤堿對(duì)大鼠瘤體P53和P16蛋白及基因表達(dá)的影響

正常對(duì)照組大鼠肺組織上均有P53和P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)。模型組大鼠肺瘤體組織上有大量P53和P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)，P53mRNA和P16mRNA高表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。環(huán)磷酰胺組P53和P16蛋白陽(yáng)性率明顯降低，P53mRNA和P16mRNA低表達(dá)，與模型組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示經(jīng)陽(yáng)性藥治療后，瘤體P53和P16蛋白及基因表達(dá)均降低。青藤堿治療組P53和P16蛋白陽(yáng)性率明顯降低，P53mRNA和P16mRNA低表達(dá)；與模型組比較，P＜0.05，但均未完全達(dá)到正常水平；與正常對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 青藤堿對(duì)腫瘤細(xì)胞G1、G2、M和S增殖周期比例的影響

模型組大鼠肺瘤體組織G1和G2期細(xì)胞增殖比值降低、S期顯著提高，與正常組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。環(huán)磷酰胺組G1和G2期細(xì)胞增殖比值提高、S期降低，與模型組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。青藤堿治療組G1、G2期細(xì)胞增殖比值提高、S期降低，與模型組比較（P＜0.05），但均未完全達(dá)到正常對(duì)照組水平，與正常對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

肺癌是最為常見(jiàn)、多發(fā)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人類的生命及健康[9]。肺癌的治療以手術(shù)切除、抗癌藥、化療為主，其副作用及化療反應(yīng)大，5年生存率不高。中醫(yī)中藥在對(duì)肺癌的治療上由來(lái)已久，至今有不少中醫(yī)家和學(xué)者對(duì)肺癌進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，積累了很多獨(dú)到診療經(jīng)驗(yàn)，對(duì)提高患者免疫機(jī)能、減少腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間具有一定的優(yōu)勢(shì)，已成為肺癌等惡性腫瘤腫瘤的一種有效的治療方法[10]。在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中肺癌以“積”名之，屬于“肺壅”、“肺積”之范疇，認(rèn)為癌毒先侵襲于肺而導(dǎo)致肺部癥積。肺之氣陰不足是本、瘀血、痰濁、熱毒及內(nèi)停是標(biāo)，癌毒阻于內(nèi)、阻礙肺氣，耗傷氣津、步入損途而致肺癌[11,12]。而從西醫(yī)的角度分析，肺癌的病理以身改變是由于P53和P16基因突變，G1、G2、M和S各細(xì)胞周期紊亂，由此導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和凋亡失控，引起細(xì)胞無(wú)限制性分化、增殖，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡化和轉(zhuǎn)移[13]。P53和P16基因編碼的P53和P16蛋白能直接或間接地抑制細(xì)胞周期依賴激酶的活性，負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖[14]。因此，從理論上講，任何影響P53和P16基因表達(dá)的藥物均可能與腫瘤細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和凋亡密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)基于這一理論，對(duì)青藤堿是否會(huì)影響肺癌P53和P16基因表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)的觀察和研究。

結(jié)果表明，模型組抑瘤率僅2.47%，P16mRNA和P53mRNA高表達(dá)，瘤體積、瘤質(zhì)量、P16和P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常對(duì)照組，肺瘤體組織G1和G2期細(xì)胞增殖比值降低、S期顯著提高，這證實(shí)P16和P53蛋白在Walker-256移植性肺癌起到了負(fù)調(diào)控作用，細(xì)胞增殖周期紊亂，高表達(dá)的P16和P53引起腫瘤細(xì)胞無(wú)限制性分化、增殖，使P16和P53無(wú)法起到抑癌調(diào)控作用，腫瘤瘤體積、瘤質(zhì)量因無(wú)限制性分化、增殖而增大。而在使用青藤堿注射治療10周后，青藤堿組抑瘤率達(dá)30.15%，瘤體積、瘤質(zhì)量、P16和P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，P16mRNA和P53mRNA低表達(dá)。青藤堿（Sinomenine）又名防己堿，是從防己科植物青風(fēng)藤的干燥根莖中采用化學(xué)方法分離提取的純生物堿[15]。在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，青藤堿對(duì)腫瘤細(xì)胞G1周期阻滯，誘導(dǎo)腫瘤凋亡，對(duì)G2期也有一定的抑制作用[16,17]。在實(shí)驗(yàn)中，青藤堿通過(guò)對(duì)P16和P53負(fù)調(diào)控作用而發(fā)揮抑癌作用，這一作用雖無(wú)陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺組強(qiáng)，但與其作用類似，調(diào)整腫瘤細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞分化、增殖。在青藤堿對(duì)照組中，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，顯示本組G1和G2期細(xì)胞比值提高，S期細(xì)胞比例降低，這提示青藤堿通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的G1、G2、S期這一細(xì)胞周期限制點(diǎn)，阻滯腫瘤的生長(zhǎng)。環(huán)磷酰胺為抗腫瘤藥，在進(jìn)入體內(nèi)后先在肝臟中經(jīng)微粒體功能氧化酶轉(zhuǎn)化成醛磷酰胺。而醛酰胺不穩(wěn)定，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。環(huán)磷酰胺是雙功能烷化劑及細(xì)胞周期非特異性藥物，可干擾DNA及RNA功能，尤以對(duì)前者的影響更大，它與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA合成，對(duì)S期作用最明顯。在本實(shí)驗(yàn)中，青藤堿抑癌機(jī)制與環(huán)磷酰胺相似，但作用沒(méi)有環(huán)磷酰胺強(qiáng)，青藤堿通過(guò)影響細(xì)胞周期這一節(jié)點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表2 青藤堿對(duì)肺癌模型大鼠瘤形態(tài)及抑瘤率的影響（±s,n=10）

表2 青藤堿對(duì)肺癌模型大鼠瘤形態(tài)及抑瘤率的影響（±s,n=10）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，cP＜0.05

表3 大鼠肺組織P53、P16表達(dá)及其mRNA表達(dá)比較（±s,n=10）

表3 大鼠肺組織P53、P16表達(dá)及其mRNA表達(dá)比較（±s,n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，cP＜0.05

表4 G1、G2、M和S四增殖周期細(xì)胞比例比較（±s,n=10）

表4 G1、G2、M和S四增殖周期細(xì)胞比例比較（±s,n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，cP＜0.05

綜上所述，青藤堿可能通過(guò)影響抑癌基因P16和P53表達(dá)，并調(diào)節(jié)G1和G2和S期細(xì)胞比值而起到抑制大鼠WALKER-256移植性肺癌腫瘤細(xì)胞的分化和增殖，降低了腫瘤細(xì)胞無(wú)限制的分化風(fēng)險(xiǎn)而發(fā)揮了抑瘤作用。

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