苑文超，王 磊，馬 勇,2＊＊，黃桂成，郭 楊，

潘婭嵐1，楊博元1，董晤訓(xùn)1，宗永剛2

（1.南南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實驗室 南京 210023；2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗 揚(yáng)州 225002）

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是由汽車事故、跌倒、運(yùn)動和暴力等高能量損傷引起的疾病[1]。嚴(yán)重的SCI會損傷神經(jīng)組織，導(dǎo)致神經(jīng)功能的突然喪失。據(jù)流行病學(xué)顯示，我國SCI的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且多發(fā)于中青年[2,3]，SCI的發(fā)生不但給患者身體和精神狀態(tài)帶來了極大的影響，而且給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。脊髓損傷后自身神經(jīng)元大量丟失，且一旦損傷難以修復(fù)，因此成為骨科及神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點和難點。NSCs是能夠?qū)崿F(xiàn)自我更新、增殖和分化的神經(jīng)母體細(xì)胞，具有產(chǎn)生神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的多向分化潛能，在治療SCI方面具有巨大的應(yīng)用前景。但研究表明[5]，經(jīng)移植的NSCs在生理狀態(tài)下，大部分分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生神經(jīng)元的幾率較低，從而阻礙SCI部位的恢復(fù)。中藥復(fù)方“脊髓康”為臨床驗方，用于脊髓損傷患者的治療，療效確切[6]。前期研究表明，JSK可促進(jìn)大鼠SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)、提升SCI后脊髓內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白及mRNA的表達(dá)水平[7]。鑒于此，課題組通過對JSK調(diào)控大鼠NSCs分化方向的研究，擬為NSCs移植治療SCI提供新的研究思路和為中醫(yī)藥治療SCI提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

清潔級SD孕鼠1只，孕期13-15天，體質(zhì)量300-350 g；清潔級SD大鼠10只，雌雄均可，體質(zhì)量250-300 g。均購自南京青龍山動物繁殖中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2012-0008。

1.1.2 藥物及試劑

脊髓康（生黃芪30 g，當(dāng)歸12 g，丹參20 g，地鱉蟲10 g，赤芍12 g，淫羊藿10 g，蜈蚣1條等）為我們臨床經(jīng)驗方（國家發(fā)明專利ZL200910026193.7）（鑒定人：馬勇；工作單位：南京中醫(yī)藥大學(xué)；職稱：教授），其生藥由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基、B-27（無血清添加劑）、多聚賴氨酸（PLL）、谷氨酰胺（Glutamin）、FBS、HBSS溶液均購自美國Gibco公司;堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表 皮 生 長 因 子（epidermal growth factor，EGF）均購于美國 PeproTech公司；二脒基苯基吲哚（4′6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride，Dapi），購于Sigma公司，大鼠抗Nestin抗體、GFAP抗體、βⅢ-Tubulin抗體均購于美國CST公司，二抗Alexa488、Alexa 594均購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備

“脊髓康”原方，加10倍水量，常法煎煮，濾液濃縮至2 g·mL-1，4℃保存?zhèn)溆谩：幯褰M以生藥量20 g·kg-1灌胃，連續(xù)給藥3天。末次給藥后1 h經(jīng)乙醚呼吸麻醉，腹動脈采血，每只大鼠采血5 mL,室溫靜置2 h[8]，3000 r·min-1離心6 min，分離血清，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝，-40℃保存?zhèn)溆?。按照上述方法另取空白血? mL以稀釋含藥血清濃度。

1.2.2 原代NSCs的分離、培養(yǎng)以及鑒定1.2.2.1 原代NSCs的分離、培養(yǎng)

取孕期13-15天SD大鼠，2.5%戊巴比妥鈉麻醉，剖腹取出胎鼠，迅速置于冰上；75%乙醇浸泡消毒后，完整取出大腦及腦干；體式顯微鏡下，暴露海馬體，剝離血管膜，剪碎海馬體至1-2 mm3大小，暫存于0℃HBSS溶液中；用5 mL注射器緩慢吹打形成細(xì)胞懸液；400目濾網(wǎng)過濾，收集懸液；1000 rpm離心5 min，移去上清，以無血清培養(yǎng)基重懸；計數(shù)后，以106·mL-1密度接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24 h后全量換液，首次換液后每3天半量換液。約7-8天后形成神經(jīng)球，以機(jī)械吹打法進(jìn)行傳代。

1.2.2.2 原代NSCs鑒定

將部分神經(jīng)球或消化后的單個細(xì)胞接種到PLL(濃度為0.1 mg/mL)處理的蓋玻片上，繼續(xù)培養(yǎng)15 min（神經(jīng)球）或過夜（單個細(xì)胞），4%多聚甲醛固定15 min后，PBS潤洗（5 min×3），0.2%Triton×-100室溫處理15 min，PBS潤洗（5 min×3），1%BSA常溫封閉1 h，PBS潤洗（5 min×3）加入鼠抗Nestin一抗，4℃過夜。次日，PBS潤洗（5 min×3），加入FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗，常溫孵育2 h，PBS潤洗（5 min×3），DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，室溫5 min，PBS潤洗（5 min×3），封片、拍照。

1.2.2.3 NSCs分化后行免疫化學(xué)染色

將NSCs接種于經(jīng)PLL處理過的24孔培養(yǎng)板中，每孔約接種40個神經(jīng)球，加入500 μL 10%FBS完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，2-3天后全量換液，7天后行βIII-Tubulin、GFAP免疫熒光染色，Alexa 594標(biāo)記神經(jīng)元骨架，Alexa 488標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)膜蛋白，免疫熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 “脊髓康”含藥血清干預(yù)NSCs的分化情況1.2.3.1 實驗分組

10%FBS誘導(dǎo)分化后，每孔分別加入10%、5%、2.5%的脊髓康含藥血清，即JSK高、中、低劑量組（JSKH、JSK-M、JSK-L），2.5%、5%含藥血清組用空白血清稀釋，臨用前將各組血清加入培養(yǎng)液中，并使培養(yǎng)液中含藥血清終濃度為10%，同時設(shè)置不加含藥血清（Blank）組（對照組），每組分別重復(fù)3次以確保穩(wěn)定性。

1.2.3.2βⅢ-Tubulin、GFAP免疫熒光染色

（1）不同視野下計算βⅢ-Tubulin、GFAP細(xì)胞百分比

待以上兩組NSCs貼壁分化7天后，分別行βⅢ-Tubulin、GFAP免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察、拍照。每組各取30個視野，分別計算出βⅢ-Tubulin、GFAP陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

（2）不同視野下對βⅢ-Tubulin、GFAP細(xì)胞熒光定量

應(yīng)用Image-Pro Plus軟件對各組βⅢ-Tubulin、GFAP陽性細(xì)胞進(jìn)行Area（Area of interest）、累計光密度（IOD）定量，并計算Area（紅光）/Area（綠光）、IOD（紅光）/IOD（綠光）的百分比，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實驗所得數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。P＜0.05具顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 原代NSCs培養(yǎng)

原代分離的NSCs，懸浮于無血清培養(yǎng)基中，3-4天后單細(xì)胞逐漸形成、大小不一的細(xì)胞團(tuán)，待7-8天后，細(xì)胞團(tuán)逐漸生長成神經(jīng)球形，如圖1所示。

2.2 原代NSCs的鑒定

將生長狀態(tài)良好的第4代NSCs行免疫化學(xué)染色，行Dapi、Nestin雙標(biāo)，如圖2所示。

2.3 在“脊髓康”作用下，NSCs的分化情況

NSCs經(jīng)JSK-H、JSK-M、JSK-L含藥血清干預(yù)分化7天后，行βⅢ-Tubulin、GFAP免疫熒光雙標(biāo)，如圖3所示。

2.4 βIII-Tubulin、GFAP的陽性細(xì)胞表達(dá)的百分比比較

如表1所示，JSK-H、JSK-M、JSK-L與Blank比較βIII-Tubulin百分比明顯增高（P＜0.05），JSK-H與JSKM、JSK-L比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；JSK-H、JSKM、JSK-L與Blank比較GFAP百分比明顯降低（P＜0.05），JSK-H與JSK-M、JSK-L、比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 βIII-Tubulin、GFAP的陽性細(xì)胞表達(dá)熒光定量百分比比較

圖1 a、b、c分別是NSCs在100、200、400倍顯微鏡下的生長狀態(tài)

圖2 a：NSCs形成神經(jīng)球后的鑒定；b：NSCs神經(jīng)球貼壁24 h后的鑒定。

JSK-H、JSK-M、JSK-L與Blank相比有顯著差異（P＜0.05）；JSK-H與JSK-M、JSK-L均有顯著差異（P＜0.01）。

圖3 A、B、C、D分別為脊髓康含藥血清高、中、低劑量組和空白組。

表1 βIII-tubulin、GFAP陽性細(xì)胞百分比比較

3 討論

NSCs是一類具有分裂潛能和實現(xiàn)自我更新能力的母細(xì)胞，可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。通過移植的方式將NSCs植入宿主體內(nèi)，不但能夠向神經(jīng)系統(tǒng)的病變部位遷移、趨化，而且能夠存活、增殖，分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)損傷部位功能的部分恢復(fù)。目前，NSCs移植技術(shù)業(yè)已應(yīng)用于腦梗塞、腦中風(fēng)、脊髓損傷等疾病的治療當(dāng)中，并取得了一定進(jìn)展[12]。

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，通過誘導(dǎo)的方法促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，有利于神經(jīng)受損后神經(jīng)功能的恢復(fù)[13]。然而，在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)NSCs分化后，其形成的大量的膠質(zhì)細(xì)胞，以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主，而神經(jīng)元細(xì)胞卻很少。在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速生長，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞生長緩慢，甚至停止生長，最后大量死亡，給后期的NSCs體內(nèi)回輸實驗帶來了諸多困難。如何有效的抑制膠質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的生長儼然已是亟待解決的問題。脊髓損傷后，神經(jīng)功能的恢復(fù)主要依賴于神經(jīng)元對神經(jīng)通路的重建，但是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的大量產(chǎn)生會阻礙神經(jīng)通路的形成，并且導(dǎo)致脊髓受損部位瘢痕的產(chǎn)生[14]。因此，通過調(diào)控因素抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、定向誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞并促進(jìn)其生長，對于SCI的治療意義重大。

圖4 βIII-Tubulin、GFAP的陽性細(xì)胞表達(dá)熒光定量百分比

JSK是我們結(jié)合多年臨床實踐經(jīng)驗，篩選出具有“祛瘀通督，溫腎利濕，調(diào)和氣血”功效的中藥復(fù)方。以大補(bǔ)元?dú)庵S芪為君藥；配以理氣之枳實，補(bǔ)血之當(dāng)歸，清熱涼血之赤芍加強(qiáng)調(diào)和氣血之力；又配以活血化瘀之川芎、丹參，攻下逐瘀之大黃祛瘀生新；更加搜經(jīng)剔絡(luò)之水蛭、蜈蚣和地鱉蟲等蟲類藥通督。諸藥配合，共奏“袪瘀通督”之功效。以溫補(bǔ)腎陽之肉蓯蓉、仙靈脾、益智仁治腎之虛寒；在上之濕治以行氣化濕之厚樸；在下之濕治以利水滲濕之澤瀉、茯苓，車前子。諸藥配合，共奏“溫腎利濕”之功效。前期基礎(chǔ)研究及臨床研究均提示該方對SCI有著良好的功效，在改善脊髓微環(huán)境，促進(jìn)SCI后患者神經(jīng)功能的恢復(fù)方面療效顯著[15-17]。基于該方的良好療效及神經(jīng)元在SCI后發(fā)揮的重要作用，本實驗即嘗試探討JSK治療SCI是否與其促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元的作用存有一定聯(lián)系，實驗結(jié)果（圖3、4）顯示，JSK能促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化，且存在一定的量效關(guān)系。NSCs分化的調(diào)控機(jī)制主要與微環(huán)境、基因和信號通路三個方面有關(guān)[18]?！凹顾杩怠备纳萍顾栉h(huán)境的作用已經(jīng)得到證實[15,19]，但其干預(yù)NSCs分化的分子機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步探索。

本實驗仍存在的問題：1、在取原代NSCs時，為保證孕鼠的孕期的一致性，課題組采用觀察未受孕大鼠的動情周期[20]的方法，雖達(dá)到了孕期一致的目的，但是浪費(fèi)了大量時間和精力。目前，課題組也在尋求簡便易行的方法；2、雖然JSK含藥血清促進(jìn)了NSCs向神經(jīng)元分化，但是其具體的分子機(jī)制尚不清楚，這是課題組下一步研究的方向；3、人體是一個復(fù)雜的環(huán)境，如何模擬人體內(nèi)部環(huán)境，進(jìn)而保證NSCs分化后神經(jīng)元細(xì)胞的存活的問題也是我們努力的方向。

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