韓墨，王燕，楊志鵬，張志偉，王婷

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省微生物重點實驗室，山東濟(jì)南250353）

內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶乳酸菌的篩選及體外益生效果評價

韓墨，王燕，楊志鵬，張志偉，王婷*

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省微生物重點實驗室，山東濟(jì)南250353）

對內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶中分離出的8株乳酸菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及16S rDNA鑒定，確定其中包括鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌。然后進(jìn)一步對菌株的酸、膽鹽、人工胃腸液耐受性、膽固醇降解能力及自由基清除能力進(jìn)行體外益生效果評價。結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌217-3對pH=1.5的強(qiáng)酸和人工胃腸液有較高的耐受性，同時還能耐受1.5%的膽鹽。此外，其膽固醇降解和自由基清除能力也具有較高的水平。綜上所述，鼠李糖乳桿菌217-3具有顯著的益生性能，為高活性乳酸菌菌劑及相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

乳酸菌；抗逆性；降膽固醇；抗氧化

目前世界上常用于益生菌的菌株大多為乳酸菌，如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和雙歧乳桿菌等一些菌株。但并不是這些菌株的每一株菌都可以作為益生菌，只有經(jīng)過科學(xué)驗證的菌株才可以作為益生菌。同時，并不是每一株益生菌都是全面手，能夠發(fā)揮所有的健康功效[1]。近年來，乳酸菌產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，平均年增長幅度達(dá)到了20%左右。因此，建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的乳酸菌菌種資源庫，并在此基礎(chǔ)上篩選和開發(fā)適合我國乳品行業(yè)和乳酸菌制劑行業(yè)發(fā)展的益生乳酸菌菌種、發(fā)酵劑和益生菌制劑顯得尤為必要。

內(nèi)蒙古是我國主要牧區(qū)之一，牧民將采集的鮮奶通過自然發(fā)酵做成酸奶、奶酪等乳制品，具有提高營養(yǎng)、延長鮮奶保質(zhì)期等優(yōu)點。這些傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品含有豐富的乳酸菌資源，菌株經(jīng)過長期的自然進(jìn)化，發(fā)酵出的傳統(tǒng)乳制品有著獨特的結(jié)構(gòu)和風(fēng)味，并具有良好的益生保健功能[2]。因此，充分挖掘和高效利用這些寶貴的菌種資源成為目前益生乳酸菌研發(fā)的重要方向。本研究主要通過對內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶中乳酸菌菌株的模擬人工胃液耐受性、膽鹽耐受性、體外降膽固醇及抗氧化活性進(jìn)行測定，著力于篩選出具有潛在益生特性的優(yōu)良菌株，為今后開發(fā)新型功能性益生菌制品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛膽鹽、膽固醇、胃蛋白酶、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：生工生物工程有限公司；鄰苯二甲醛：天津精細(xì)化工研究所；氫氧化鉀、正己烷、冰醋酸、濃硫酸：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3900紫外-可見分光光度計：日本日立公司；BX53F正置熒光顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.3 培養(yǎng)基與試劑

MRS液體培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母粉 5.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐溫 80 1.0mL、磷酸氫二鉀2.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳 0.054 g，蒸餾水 1 000mL，1 mol/L 乙酸調(diào)pH值為6.5，121℃滅菌15min。

膽固醇溶液配法：將膽固醇0.06 g、牛膽鹽0.12 g、蔗糖脂肪酸脂0.06 g、冰乙酸5mL、吐溫0.6mL加于試管中，超聲振蕩至完全溶解[4]。

0.2mg/mL膽固醇培養(yǎng)基：在300mL滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中加入5.6mL現(xiàn)配的膽固醇溶液，12mL 6 mol/L NaOH溶液，振蕩混勻。其中6 mol/L NaOH溶液滅菌處理，膽固醇溶液用0.2 μm的有機(jī)細(xì)菌過濾頭過濾。

人工胃液：將胃蛋白酶過濾除菌，溶解在滅菌的0.5%NaCl溶液中，終濃度為3 g/L，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2.0。

人工腸液：胰蛋白酶（1 g/L）和豬膽鹽（1 g/L）溶解在滅菌的0.5%NaCl溶液中，并調(diào)節(jié)pH值到8.0[5]。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株的分離純化

吸取100 μl內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品于離心管中，加入到900 μL生理鹽水中，充分振蕩混勻后，稀釋到10-4、10-5，取100 μL稀釋液涂布于MRS瓊脂平板上，置于37℃厭氧培養(yǎng)24 h～72 h，挑取典型單菌落，劃線分離純化。對分離所得的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗。

1.4.2 菌株的16S rDNA分子鑒定

提取菌株的基因組DNA進(jìn)行片段擴(kuò)增：采用乳酸菌16S rDNA基因的通用引物，正向引物：A27F：5’-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTAC GA-3，反向引物：A1495R：3’-GCAGAGTTCTCGGA GTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5’，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)片段長度約1 500 bp。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物委托山東省農(nóng)科院進(jìn)行測序。

1.4.3 菌株對酸的耐受性

為了研究經(jīng)過篩選鑒定的八株酸桿菌的酸脅迫抵抗能力，對酸脅迫下他們的存活率進(jìn)行檢測。將2%過夜培養(yǎng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到5mL新鮮MRS培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)至OD600=1.0，離心收集菌體，棄掉培養(yǎng)基，將菌體懸浮在pH值為1.5、2.5的MRS培養(yǎng)基中，根據(jù)胃酸的酸度和食物在胃中的停留時間，將菌株培養(yǎng)基在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，等比稀釋，涂布MRS平板，活菌計數(shù)，每個試驗重復(fù)3次，求其平均值，計算其存活率[6]。

式中：A1為0 h時的活菌數(shù)；A2為4 h時的活菌數(shù)。

1.4.4 菌株對膽鹽的耐受性

將1%過夜培養(yǎng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到5mL新鮮MRS培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)至OD600=1.0，離心收集菌體，棄掉培養(yǎng)基。將菌體懸浮在牛膽鹽濃度為0.5%、1.0%、1.5%的MRS培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，等比稀釋，涂布MRS平板，活菌計數(shù)，每個試驗重復(fù)次，求其平均值[7-8]。

1.4.5 菌株對人工胃腸液的耐受性

將2%過夜培養(yǎng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到5mL新鮮的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)至OD600=1.0，離心收集菌體，棄掉培養(yǎng)基，加入等體積的人工胃液或者人工腸液，37℃靜止培養(yǎng)6 h后，等比稀釋，涂布MRS平板，活菌計數(shù)，每個試驗重復(fù)3次，求其平均值[9]。

1.4.6 菌株對膽固醇的降解作用試驗

1.4.6.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將膽固醇工作液分別配制成不同濃度的膽固醇溶液（30、35、40、45、50、55μg/mL），測定吸光值（A550nm）并繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6.2 膽固醇含量的測定

對鄰苯二甲醛法進(jìn)行改良。取樣品4mL加到具塞試管中，加入33%KOH溶液3mL混勻，再加入95%乙醇3mL，蓋塞漩渦振蕩1.5min。60℃水浴15min，迅速冷卻至室溫。向原試管中加入正己烷3mL，混勻后加入蒸餾水2mL，混勻靜置10min后，取2mL上層液體加至干凈的玻璃試管中，于50℃恒溫箱中揮發(fā)。待揮發(fā)完畢后向每個試管中分別加入2mL當(dāng)天配制的鄰苯二甲醛工作液，混勻后靜置10min，再加入濃H2SO41mL，并迅速混勻，靜置10min后測定550 nm下的吸光值[10-11]。

1.4.6.3 菌株膽固醇去除能力測定

供試菌株以2%接種于MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基，37℃發(fā)酵24 h。分別測定培養(yǎng)上清液（12 000 r/min，10min，4℃）中膽固醇含量，計算膽固醇去除率。膽固醇去除率/%=（初始膽固醇含量-上清液膽固醇含量）/初始膽固醇含量×100[12]。

1.4.7 菌株清除DPPH自由基能力的測定

取不同濃度的8種菌液1mL（109、1010CFU/mL）加入2mL DPPH乙醇溶液（0.5 mmol/L），混合均勻后室溫下避光反應(yīng)30min，4℃、8 000 r/min離心10min，取上清液，于517 nm波長處測吸光度，無菌水空白調(diào)零。空白組以等體積乙醇代替DPPH溶液，對照組以等體積無菌水代替菌液。DPPH自由基清除率計算見公式[13]。

式中：A為空白組的吸光度；A0為對照組的吸光度；As為樣品組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與鑒定

對內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶樣品進(jìn)行菌株分離，挑選在MRS平板上菌落形態(tài)為圓形、表面光滑、乳白色的小菌落，并結(jié)合革蘭氏染色陽性，無芽孢、不產(chǎn)過氧化氫酶的實驗結(jié)果，最后經(jīng)16s rDNA檢測，確定為其中3株為鼠李糖乳桿菌、2株植物乳桿菌、1株干酪乳桿菌、1株瑞士乳桿菌、1株嗜熱鏈球菌。將其分別命名為217-1～217-8進(jìn)行后續(xù)體外益生效果評價。

2.2 菌株對酸的耐受性評價

選取指數(shù)生長期的菌株進(jìn)行酸脅迫耐受性試驗，8株菌株在未進(jìn)行酸脅迫處理時（0 h），它們的菌落活菌數(shù)為相同數(shù)量級。伴隨酸脅迫處理時間的延長，不同菌株對酸脅迫耐受力產(chǎn)生差異，如圖1所示。

圖1 菌株在pH 1.5、2.5條件下的存活率變化情況Fig.1 The survival rate of the strain under pH 1.5，2.5 was changed

由圖1可知，菌株217-1、217-3、217-4、217-5、217-7菌株具有良好的酸耐受性，其中菌株217-3的存活率最高，在pH1.5時為72%。在所有菌株中的抗酸脅迫能力是最強(qiáng)；而菌株217-2、217-6、217-8抗酸脅迫能力相對較差，在pH值為1.5、2.5時，存活率出現(xiàn)了較大程度的下降。以上實驗證明不同的乳酸菌菌株的抗酸脅迫能力不同，且菌株的抗酸脅迫能力不具備一致性。尤其以217-3最適合在強(qiáng)酸性條件下生長。

2.3 菌株對膽鹽的耐受性評價

以篩選出的酸耐受性好的5株菌株為出發(fā)菌株，參考消化道中膽鹽的濃度（在進(jìn)食消化的開始1 h，其質(zhì)量濃度為15 g/L～20 g/L，之后其質(zhì)量濃度降為3 g/L左右）[14]，對其膽鹽耐受性檢測，結(jié)果見表1。

表1 不同膽鹽質(zhì)量濃度下菌株的生長情況Table 1 Tolerance of the strains to different concentrations of bile salts

如表1所示，我們篩選出膽鹽耐受性較好的菌株為 217-1、217-3、217-4、217-5。其中 217-3 對膽鹽耐受力較強(qiáng)。在1.5%的膽鹽濃度條件下，具有較好的耐受性且菌落數(shù)呈現(xiàn)了明顯增長，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，該菌株對膽鹽的耐受性亦高于已報道鼠李糖乳桿菌膽鹽耐受水平，具有較高的研究價值。

2.4 菌株對人工胃腸液的耐受性評價

以篩選得到的對酸、膽鹽具有良好耐受性的4株菌株為出發(fā)菌株，用胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽和濃鹽酸模擬人工胃、腸液，對此4株菌的人工胃腸液耐受性進(jìn)行比較。結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 菌株在pH2.0的人工胃液中活菌數(shù)變化情況Fig.2 Changes of viable count in the artificial gastric juice of pH2.0

圖3 菌株在pH8.0的人工腸液中活菌數(shù)變化情況Fig.3 Changes of viable count in the artificial intestinal fluid of pH8.0 strain

由圖2、圖3可知，菌株217-1對人工胃、腸液耐受性較高，該菌株在pH=2.0的人工胃液中處理6 h，能保持6.3×108cfu/mL活菌數(shù)，在pH=8.0的人工腸液中處理6 h，能保持2.3×108cfu/mL活菌數(shù)，該活菌數(shù)的保持，為菌株在腸道內(nèi)黏附和定植提供了良好的保障。

2.5 菌株株的體外降膽固醇能力

2.5.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

圖4為膽固醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖4 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Cholesterol standard curve

回歸方程為y=0.040 1x-0.878 5，R2=0.990 9。由試驗結(jié)果可見，測定結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.2 菌株膽固醇去除能力測定

恒定pH值條件下菌體MRS-STC-CHOL培養(yǎng)液膽固醇含量、降解情況見表2。

表2 恒定pH條件下菌體MRS-STC-CHOL培養(yǎng)液膽固醇含量、降解情況Table 2 Cholesterol content and degradation of MRS-stc-chol culture medium under constant pH conditions

由表2可知，菌株都具有降解膽固醇的能力，但是其能力大小因菌株的不同有所差異。其中217-1、217-5和217-8的體外降解膽固醇能力較強(qiáng)，膽固醇降解率63.4%、59.5%和47.6%。而其他的菌株的降解率出除了217-6以外都在30%以上。

2.6 菌株清除DPPH自由基能力檢測

菌株對DPPH自由基的清除能力比較見圖5。

圖5 菌株對DPPH自由基的清除能力比較Fig.5 Comparison of the strains for scavenging effects on DPPH free radicals

由圖5可知，不同菌株的DPPH自由基清除能力差異顯著，且菌株的清除能力與濃度呈正比，隨無細(xì)胞提取液濃度的增加，DPPH自由基的清除能力不斷提高。在受試的8株乳酸菌中，217-1在1010CFU/mL時對自由基的清除能力最高，清除率為54.26%。此外，217-5也表現(xiàn)出較高的自由基清除能力，在1010CFU/mL時對自由基的清除率均在50%以上。

3 討論

本研究從內(nèi)蒙傳統(tǒng)酸奶中分離出的乳酸菌菌株出發(fā)，經(jīng)過革蘭氏染色、過氧化氫酶及16S rDNA鑒定，確定了其乳酸菌的種類。然后進(jìn)行體外耐酸、耐膽鹽、耐人工胃腸液能力和將降解膽固醇能力的測定；篩選出1株具有高抗活性的乳酸菌。旨在了解不同屬乳酸菌耐酸耐膽鹽性及降解膽固醇能力，從而篩選出既具有耐酸耐膽鹽又有良好降膽固醇能力的優(yōu)良菌株217-1，為開發(fā)乳酸菌制劑奠定一定的理論基礎(chǔ)。

[1]丁武蓉.青藏高原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶中乳酸菌多樣性及其益生功能研究[D].蘭州:蘭州大學(xué),2014

[2]張和平.中國益生乳酸菌及益生發(fā)酵乳研究開發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展對策[J].中國乳業(yè),2009,32(8):51-54

[3]吳燕.內(nèi)蒙古牧區(qū)奶業(yè)發(fā)展研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古大學(xué),2010

[4]王曉君,潘道東,張佳程.乳酸菌降膽固醇體外篩選的培養(yǎng)基研究[J].中國釀造,2010,29(4):26-28

[5]程秀芳,王叢叢,谷巍.乳酸菌在體外模擬胃腸環(huán)境中的抗性研究及其發(fā)酵特性[J].藥學(xué)研究,2012,31(1):6-8

[6]胡愛華,敖曉琳,陳岑,等.乳酸菌耐酸耐膽鹽機(jī)制的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2015,36(8):380-383

[7]Zhao X,Wei X,Chen D,et al.Acid and Bile Salt Tolerance of Exopolysaccharide-Producing Strains of Lactobacillus plantarum[J].Journal of Dairy Science&Technology,2016,39(3):1-3

[8]焦月華,張?zhí)m威,易華西,等.酸牦牛乳中乳酸菌降膽固醇作用及膽鹽耐受性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,43(2):6-12

[9]孫艷波.酸奶用乳酸菌的人工消化耐受性研究[J].中國乳品工業(yè),2005,33(9):30-31

[10]唐雅茹,于上富,國立東,等.一株降膽固醇乳桿菌的篩選及其益生作用的研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(1):142-144,152

[11]丁苗,劉洋,葛平珍,等.發(fā)酵酸肉中降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及降膽固醇作用[J].食品科學(xué),2014,35(19):203-207

[12]李昵.降膽固醇乳酸菌的篩選及其降解機(jī)理研究[D].廈門:集美大學(xué),2012

[13]陳芳甜.觀賞海棠果抗氧化活性的研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012

[14]金磊,王麗,鐘青萍.植物乳桿菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的初步研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(16):187-190

Screening of Lactic Acid Bacteria in Traditional Yoghurt of Inner Mongolia and Evaluation of Its Benefit in vitro

HAN Mo，WANG Yan，YANG Zhi-peng，ZHANG Zhi-wei，WANG Ting*
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbiology，Qilu University of Technology（Shandong Academy of Science），Jinan 250353，Shandong，China）

In Inner Mongolia traditional yogurt in eight strains of lactic acid bacteria strains were isolated from the morphological and 16S rDNA appraisal，determine including rhamnose lactobacillus，plant lactobacillus，lactobacillus casei and lactobacillus，Swiss hot streptococcus.Then further the evaluation of the probiotic effect of acid，bile salt，artificial gastroenteric fluid tolerance，cholesterol degradation ability and free radical removal ability were further evaluated.The results showed that lactobacillus lactobacillus was 217-3，which had high tolerance to the strong acid and artificial gastroenteric acid of 1.5，and was also able to withstand 1.5%of bile salts.In addition，the cholesterol degradation and free radical removal ability also had high levels.From what has been discussed above，rhamnose lactobacillus has significant live performance，217-3 for highly active lactic acid bacteria bacterium agent and related fermentation product development has laid a theoretical foundation.

lactic acid bacteria；stress resistance；cholesterol lowering；antioxidant

韓墨，王燕，楊志鵬，等.內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶乳酸菌的篩選及體外益生效果評價[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：152-156

HAN Mo，WANG Yan，YANG Zhipeng，et al.Screening of Lactic Acid Bacteria in Traditional Yoghurt of Inner Mongolia and Evaluation of Its Benefit in vitro[J].Food Research and Development，2018，39（1）：152-156

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.030

山東省自然科學(xué)基金（ZR2016CB14）；國家自然科學(xué)基金項目（31701576）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201610431013）

韓墨（1992—），男（漢），碩士研究生，研究方向：微生物資源開發(fā)。

*通信作者：王婷（1985—），女，博士。

2017-05-23