（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

LILIC-Q/TOF對乳粉中羥脯氨酸的確證分析

王駿，胡梅，李恒，徐大瑋，薛霞，祝建華

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

建立親水作用色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測定乳粉中羥脯氨酸的確證方法。乳粉樣品經(jīng)鹽酸水解后，以HLB固相萃取柱凈化，經(jīng)親水作用色譜柱分離后，使用超高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜分別進(jìn)行全掃描和羥脯氨酸的二級質(zhì)譜掃描分析，以羥脯氨酸的色譜保留時(shí)間、母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)對其進(jìn)行確證分析。方法的檢測限優(yōu)于0.1mg/kg，可滿足乳粉中非法添加羥脯氨酸的確證分析要求。

親水作用色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜；乳粉；羥脯氨酸；確證分析

羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）是膠原蛋白特有的氨基酸，因其在彈性蛋白中含量極少，且在其他蛋白中不存在，常作為膠原蛋白的特征標(biāo)記物。動物水解蛋白是一種廉價(jià)蛋白原料，是以牛皮及其制品的下腳料等經(jīng)粗加工后制成的水解蛋白，部分不良廠商在乳粉中摻入廉價(jià)的水解動物蛋白來替代乳蛋白，以提高乳中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低成本。由于水解過程中添加重鉻酸鉀和重鉻酸鈉等重金屬鹽，具有潛在的致癌和致畸作用，早在2009年就被列入我國“第二批食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單”。羥脯氨酸作為這類蛋白特有的氨基酸，現(xiàn)已被作為非法添加動物水解蛋白的檢測標(biāo)記物。目前報(bào)道的羥脯氨酸的檢測方法主要有：分光光度法[1-8]、離子色譜法[9]、液相色譜法[10-18]、液相色譜-質(zhì)譜法[19-21]、自動氨基酸分析儀法[22-24]等。作為禁用物質(zhì)標(biāo)記物的檢測，結(jié)果的定性尤為重要，而上述方法在結(jié)果的準(zhǔn)確確證方面還有不同程度的欠缺，即便使用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測，由于奶粉中存在母離子和子離子均相近的亮氨酸和異亮氨酸，仍可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)近年來日趨成熟，通過飛行時(shí)間質(zhì)譜測定目標(biāo)物和其碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，對目標(biāo)物進(jìn)行定性，有助于排除假陽性結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對禁用物質(zhì)的確證分析。本文建立超高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜確證檢測乳粉中羥脯氨酸的方法，對經(jīng)氯胺-T分光光度法檢測羥脯氨酸為陽性的乳粉樣品進(jìn)行了確證分析，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與條件

Acquity UPLC超高效液相色譜儀：美國Waters公司，由二元泵、柱溫箱、自動進(jìn)樣器組成；Acquity UPLC BEH HILIC 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）：Waters公司；流動相A為乙腈，流動相B為10 mmol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?～4min，由85%A線性變化至75%A；4min～6min線性變化至60%A，6min～8min線性變化至85%A，流速為0.4mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量為10 μL。

XEVO QTOF型四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國Waters公司，配電噴霧電離源（ESI），帶有Masslynx 4.1和Targelynx軟件。操作參數(shù)為：電噴霧電離源正離子模式，毛細(xì)管電壓3.5 kV，錐孔電壓18 V，提取錐孔電壓4 V；源溫135℃，脫溶劑氣溫度450℃，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流量50 L/h。分別采用MSE和MS/MS兩種掃描模式，MSE采集模式：低能通道碰撞能量為6 eV，高能通道碰撞能量為10 eV～30 eV，質(zhì)量掃描范圍 50 amu～600 amu；MS/MS采集模式：Q1設(shè)定為單位質(zhì)量分辨，母離子質(zhì)量數(shù)為132.06，碰撞能量為18 eV，二級質(zhì)譜掃描范圍50 amu～600 amu。采用200 pg/μL亮氨酸-腦啡肽溶液進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正（Lockmass），參比質(zhì)量為556.277 1 amu。

1.1.2 試劑和材料

羥脯氨酸標(biāo)樣：中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乙腈（色譜純）：美國 Fisher公司；乙酸銨（純度＞99%）：美國Sigma公司；鹽酸（優(yōu)級純）、苯酚（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為Mili-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）現(xiàn)制備；HLB固相萃取柱：200mg/6mL，美國Waters公司；0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜：天津津滕公司；全脂乳粉6批，嬰幼兒配方乳粉5批：分別購自濟(jì)南、青島的超市。

1.2 樣品處理

稱取0.5 g乳粉樣品，精確至0.000 1 g，至20mL水解管中，加入5.00mL濃鹽酸（優(yōu)級純），滴加3滴50 g/L苯酚水溶液（新蒸餾的苯酚），充氮2min，封口，在110℃水解24 h，取出冷卻，同時(shí)做空白試驗(yàn)。打開水解管，經(jīng)濾紙過濾到100mL容量瓶中，用超純水反復(fù)沖洗濾紙和漏斗，定容、搖勻。

取一支HLB固相萃取柱，先用3mL甲醇、3mL水活化，取水解液5mL上樣，棄去最初的2mL，收集3mL流出液于15mL離心管中，置于氮吹儀上氮吹15min，取 50 μL，加入 950 μL 乙腈混勻，經(jīng) 0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法

乳粉樣品的水解采用了通用的氨基酸水解條件，考慮到要采用親水色譜分離、質(zhì)譜檢測進(jìn)行確證，還需進(jìn)一步對樣品水解液進(jìn)行凈化和處理。乳粉水解液為強(qiáng)酸性溶液，而且含有未充分水解的成分，在進(jìn)行液質(zhì)分析前，需去除這些干擾。羥脯氨酸在水解液中為陽離子，具有較強(qiáng)的極性，采用HLB固相萃取柱凈化時(shí)，會直接穿過凈化柱，而其余大分子的、極性較弱的組分則會被吸附在HLB柱中，實(shí)現(xiàn)羥脯氨酸與干擾組分的分離。因此本試驗(yàn)采用直接穿透法，取一部分過HLB柱的水解液，再進(jìn)行氮?dú)獯祾呲s酸，使水解液中的鹽酸大部分揮發(fā)，最后以乙腈稀釋、定容。經(jīng)過這樣的處理步驟，羥脯氨酸水解液得到一定程度的凈化，大量的鹽酸被除去，最終進(jìn)樣的溶液也調(diào)整到適合親水色譜測定的組成，可以獲得較為理想的結(jié)果。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

由于羥脯氨酸的極性很強(qiáng)，在反相色譜柱上無法保留，難以與其他極性組分分離，無法避免整數(shù)質(zhì)量相同的亮氨酸、異亮氨酸等組分的干擾，即使使用高分辨質(zhì)譜也會因極強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)無法分辨。羥脯氨酸具有氨基酸典型的兩性特征，在酸性介質(zhì)中呈陽離子，適合使用親水作用色譜保留和分離。本試驗(yàn)選用了Wa ters公司的Acquity UPLC BEH HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）做為分析柱，以乙腈和10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明羥脯氨酸峰形對稱，分析時(shí)間短，包括系統(tǒng)平衡在內(nèi)，僅需6min即可完成一個(gè)樣品的確證分析，羥脯氨酸提取離子流圖見圖1。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

圖1 標(biāo)樣（A）和陽性（B）樣品中的羥脯氨酸提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram for hydroxyproline of Standard sample（A）and positive sample（B）

將100 ng/mL的羥脯氨酸標(biāo)樣溶液注入質(zhì)譜儀，對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的靈敏度，同時(shí)采集確認(rèn)羥脯氨酸的子離子信息。錐孔電壓和碰撞能量是質(zhì)譜參數(shù)中最重要的兩個(gè)。錐孔電壓直接影響目標(biāo)物的靈敏度，隨著錐孔電壓的升高，目標(biāo)物響應(yīng)值逐漸增強(qiáng)，但錐孔電壓過高可能導(dǎo)致羥脯氨酸分子離子在離子源內(nèi)發(fā)生碰撞解離，反而影響母離子的靈敏度。經(jīng)試驗(yàn)，在錐孔電壓18 V、碰撞能量為6 eV時(shí)，可獲得羥脯氨酸最強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰。為得到更多的碎片離子，增強(qiáng)方法的可靠性，同時(shí)又不希望損失其準(zhǔn)分子離子的靈敏度，采用了MSE的采集模式，即同時(shí)采集2個(gè)不同碰撞能量通道的數(shù)據(jù)，低能通道監(jiān)測準(zhǔn)分子離子，高能通道采集碎片離子的信息，相應(yīng)的質(zhì)譜圖見圖2、圖3。

圖2 低碰撞能量通道下獲得的羥脯氨酸質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of hydroxyproline with a low collision energy

圖3 高碰撞能量通道下獲得的羥脯氨酸質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrogram of hydroxyproline with a high collision energy

經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化，低能通道碰撞能量為6 eV，高能通道碰撞能量為10 eV～30 eV為較理想的條件。

2.4 高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量測定在羥脯氨酸確證中的優(yōu)勢

很多嬰幼兒配方奶粉中添加了亮氨酸和異亮氨酸，它們與羥脯氨酸在電噴霧質(zhì)譜中的母離子和子離子見表1。

表1 羥脯氨酸與亮氨酸、異亮氨酸監(jiān)測離子精確質(zhì)量數(shù)Table 1 Exact mass for the monitoring ions of hydroxyproline，leucine and isoleucine

表1數(shù)據(jù)分析可知，亮氨酸、異亮氨酸的母離子、子離子完全相同，雖與羥脯氨酸的母離子、子離子化學(xué)組成不同，但精確質(zhì)量數(shù)相差均在0.05 amu以內(nèi)，在單位質(zhì)量分辨的四級桿等低分辨質(zhì)譜[1，14，22]中無法區(qū)分，即便兩個(gè)子離子的相對豐度比與羥脯氨酸不一致，也不能完全排除假陽性的結(jié)果，無法實(shí)現(xiàn)對結(jié)果的確證。

本研究建立了基于高分辨質(zhì)譜的方法，對母離子和子離子質(zhì)量測定的精度均可達(dá)2ppm以內(nèi)，在羥脯氨酸的質(zhì)量數(shù)上，能區(qū)分不超過0.000 3 amu的質(zhì)量差異，因此可以輕松識別羥脯氨酸與亮氨酸、異亮氨酸，從而實(shí)現(xiàn)對羥脯氨酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確確證。

2.5 線性范圍和檢出限

在確定的試驗(yàn)條件下，用陰性奶粉試樣制備空白基質(zhì)提取液，配制系列不同濃度（0.005μg/mL～2μg/mL）的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以各組分的峰面積（y）對其濃度（x，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=1 368.21x+38.2，相關(guān)系數(shù)（r）為 0.985，表明羥脯氨酸在0.005μg/mL～2μg/mL 濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。在空白奶粉中添加不同水平的羥脯氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行處理，當(dāng)添加量為0.1mg/kg時(shí)羥脯氨酸仍可準(zhǔn)確定性，低于此水平時(shí)，由于碎片離子[M-CO3H4]+質(zhì)譜信號強(qiáng)度不足，因此將本方法的最低檢測限定為0.1mg/kg。由于添加羥脯氨酸的標(biāo)樣進(jìn)行回收率測定不能反映膠原蛋白水解的過程，考慮到本方法為定性確證的方法，所以沒有進(jìn)行加標(biāo)回收的試驗(yàn)。

2.6 方法的應(yīng)用

應(yīng)用本方法測定了全脂乳粉、嬰幼兒配方乳粉等疑似陽性樣品11批，其中6批樣本經(jīng)確證結(jié)果為陽性，結(jié)果見表2，陽性樣品譜圖見圖4。

表2 全脂乳粉、嬰幼兒配方乳粉樣品確證結(jié)果Table 2

圖4 MS/MS模式得到的陽性樣品中羥脯氨酸母離子和子離子提取色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram for hydroxyproline of positive sample with MS/MS mode

進(jìn)一步分析樣品的配料并與生產(chǎn)商確認(rèn)，這些產(chǎn)品中添加了深海魚膠原蛋白，檢出羥脯氨酸為合理結(jié)果，這也進(jìn)一步表明本方法對結(jié)果的確證準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，超高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜測定乳粉中羥脯氨酸的方法具有操作簡單、分離效率高、定性確證準(zhǔn)確可靠等顯著特點(diǎn)，是一種對乳粉中羥脯氨酸疑似結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確確證的有效技術(shù)。

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Confirmatory Analysis of Hydroxyproline in Milk Powder by LILIC-Q/TOF

WANG Jun，HU Mei，LI Heng，XU Da-wei，XUE Xia，ZHU Jian-hua
（Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，Shandong，China）

A confirmatory analytical method was developed for the determination of hydroxyproline in milk powder using hydrophilic interaction chromatography coupled with quadrupole-time of flight-mass spectrometry（HILIC-Q/TOF）.The samples were hydrolyzed with hydrochloric acid，and cleaned up by solid phase extraction，and the protein was precipitated with acetonitrile subsequently.After separated on an Acquity UPLC BEH HILIC column，hydroxyproline was carried out in the full scan and daughter ion scan mode.The hydroxyproline was confirmed by the retention time，accurate mass of parent ion and fragment ions，and the detection limit was better than 0.1mg/kg.The method was suitable for the confirmation of hydroxyproline in milk powder．

HILIC-Q/TOF（Hydrophilic interaction chromatography coupled with quadrupole-time of flightmass spectrometry）；milk powder；hydroxyproline；confirmatory analysis

王駿，胡梅，李恒，等.LILIC-Q/TOF對乳粉中羥脯氨酸的確證分析[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：113-117

WANG Jun，HU Mei，LI Heng，et al.Confirmatory Analysis of Hydroxyproline in Milk Powder by LILIC-Q/TOF[J].Food Research and Development，2018，39（1）：113-117

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.022

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF120018）

王駿（1972—），男（漢），研究員，學(xué)士，研究方向：食品安全分析及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。

2017-03-14