趙蓓蓓 程雅婷 董 衡 李卓陽(yáng) 李冰玲 1. 廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院；. 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司（廣東廣州 510005）

25羥基維生素D檢測(cè)方法的可靠性分析

趙蓓蓓1,2程雅婷1,2董 衡2李卓陽(yáng)2李冰玲21. 廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院；2. 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司（廣東廣州 510005）

維生素D不僅在人體鈣磷代謝和骨質(zhì)鈣化中起著重要作用，而且與2型糖尿病、乳腺癌、高血壓等重大疾病有著密切關(guān)系[1,2]。然而，目前維生素D缺乏卻是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性問(wèn)題[3]，全球有近10億人維生素D不足或缺乏[4]，中國(guó)上海有近三分之一的人維生素D不足[4,5]。維生素D缺乏將導(dǎo)致佝僂病、軟骨病和骨質(zhì)疏松等疾病，同時(shí)多項(xiàng)研究表明維生素D的營(yíng)養(yǎng)水平若不能維持在最佳范圍內(nèi)，將會(huì)增加罹患糖尿病、高血壓、乳腺癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)；而過(guò)量攝入維生素D者將會(huì)導(dǎo)致中毒，因此準(zhǔn)確檢測(cè)人體維生素D營(yíng)養(yǎng)水平越來(lái)越受到重視。

在維生素D的體內(nèi)代謝物中，25羥基維生素D（25OHD）由于其在血液中的濃度高且循環(huán)周期長(zhǎng)而成為人體維生素D營(yíng)養(yǎng)評(píng)估的最佳檢測(cè)指標(biāo)。維生素D主要有維生素D2和維生素D3兩種存在形式，因此準(zhǔn)確反映人體維生素D的營(yíng)養(yǎng)水平，需同時(shí)檢測(cè)血清25OHD2和25OHD3兩項(xiàng)指標(biāo)，以兩者之和，即血清25OHD的總量來(lái)準(zhǔn)確反映人體維生素D營(yíng)養(yǎng)水平。目前25OHD的檢測(cè)有多種分析技術(shù)和方法，按原理可分為色譜質(zhì)譜法和免疫學(xué)法。不同的方法學(xué)間由于檢測(cè)原理和檢測(cè)系統(tǒng)的差異，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可靠性存在明顯差異[6]。

為了解決25OHD檢測(cè)一致性的問(wèn)題，2010年9月美國(guó)健康研究署膳食攝入部成立了維生素D標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（Vitamin D Standardization Program，VDSP），其主要目的是通過(guò)對(duì)25OHD檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)維生素D缺乏和不足的檢測(cè)、評(píng)估及補(bǔ)充治療的標(biāo)準(zhǔn)化[7]。為了達(dá)到這一目的，VDSP在世界范圍內(nèi)建立了25OHD檢測(cè)的參考方法系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）和參考測(cè)量程序（Reference Measurement Procedures，RMPs）的結(jié)果被認(rèn)為是真值。在真值的基礎(chǔ)上成立了兩類標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)，分別為美國(guó)疾病與預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control，CDC）成立的維生素D標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（Vitamin D Standardization Certification Program，VDSCP）和基于準(zhǔn)確度的定量保障項(xiàng)目（Accuracy-Based Quality Assurance Programs，ABQAP）。VDSCP由美國(guó)疾病與預(yù)防控制中心發(fā)起，主要針對(duì)25OHD檢測(cè)試劑生產(chǎn)廠商和大型的第三方獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，并將參加機(jī)構(gòu)的25OHD檢測(cè)結(jié)果與RMPs結(jié)果進(jìn)行比較；ABQAP分別由美國(guó)病理學(xué)專家協(xié)會(huì)（College of American Pathologists，CAP）和英國(guó)維生素D定量保障機(jī)構(gòu)（Vitamin D External Quality Assessment Scheme，DEQAS）分別發(fā)起，主要針對(duì)普通的醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和研究實(shí)驗(yàn)室，并將參加機(jī)構(gòu)的25OHD結(jié)果與NIST結(jié)果進(jìn)行比較。

1 基于室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果再分析不同檢測(cè)方法的可靠性

據(jù)DEQAS報(bào)告顯示，截止到2015年11月，已有來(lái)自53個(gè)國(guó)家超過(guò)2 100家實(shí)驗(yàn)室參加25OHD的室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目，參與的檢測(cè)方法種類超過(guò)26種[8，9]。其中上報(bào)參與評(píng)估的檢測(cè)方法中，數(shù)量最多的4種方法依次是DiaSorin Liaison Total、IDS-iSYS、LC-MS/MS Method、Roche Total。使用LC-MS/MS 法的參評(píng)實(shí)驗(yàn)室超過(guò)150家[10]，而且使用LC-MS/MS 法參評(píng)的實(shí)驗(yàn)室有逐年增加的趨勢(shì)。DEQAS針對(duì)25OHD項(xiàng)目所提供的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（External Quality Assessment，EQA）樣本基質(zhì)，來(lái)源于接受放血治療的血色病或紅細(xì)胞增多癥患者（采血經(jīng)過(guò)患者知情同意，經(jīng)過(guò)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)和英國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)）；為了研究基質(zhì)效應(yīng)、基質(zhì)干擾等因素，對(duì)不同方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果的影響，DEQAS會(huì)選擇性地在某些EQA樣本中，加入某些干擾物質(zhì)。同時(shí)，DEQAS自2013年4月開(kāi)始，在其提供的報(bào)告中會(huì)體現(xiàn)NIST的結(jié)果供參評(píng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全面評(píng)估。

DEQAS通過(guò)匯總25OHD室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果[8-10]，再分析后得出如下結(jié)果：①在EQA樣本中總25OHD濃度相近的情況下，大部分免疫學(xué)方法對(duì)中度脂血樣本（三甘油酸酯的濃度為4.0 mmol/L）的檢測(cè)結(jié)果與NIST結(jié)果相比，會(huì)有明顯的負(fù)偏倚。相對(duì)免疫學(xué)方法而言，HPLC和LC-MS/MS法的結(jié)果與NIST結(jié)果偏倚較小。免疫學(xué)方法的中度脂血樣本檢測(cè)結(jié)果與NIST結(jié)果的差異性，與同批次其他樣本結(jié)果的變異度相比，多無(wú)顯著變化，但Abbott，Diasorin Liaison法除外。②在EQA樣本中總25OHD的濃度相近，但含有較高比例25OHD2的（27%，22.3 nmol/L）樣本中，免疫學(xué)方法的檢測(cè)結(jié)果與NIST結(jié)果相比存在負(fù)偏倚，這一偏倚情況，在Abbott，Diasorin RIA， Diasorin Liaison法中，尤其明顯。這可能是由于這些系統(tǒng)對(duì)25OHD2檢測(cè)的特異性不夠?qū)е碌?。③在EQA樣本中總25OHD濃度較高的情況下，大部分免疫學(xué)方法的結(jié)果與NIST結(jié)果相比會(huì)有明顯的正偏倚，且同種免疫學(xué)方法不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果變異性較大。分析原因可能與較高25OHD濃度樣本，一般含有較高濃度的24,25(OH)2D有關(guān)。24,25(OH)2D在配體結(jié)合分析中會(huì)對(duì)25OHD檢測(cè)造成嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)正偏倚。當(dāng)然這一結(jié)論，DEQAS認(rèn)為有待持續(xù)準(zhǔn)確地分析24,25(OH)2D的檢測(cè)結(jié)果后，進(jìn)一步證實(shí)。④從同種方法學(xué)的25OHD檢測(cè)結(jié)果均值與NIST結(jié)果的偏倚情況看，HPLC和LC-MS/MS法的結(jié)果偏倚在－10%～15%范圍內(nèi)波動(dòng)，而大部分的免疫學(xué)方法的結(jié)果偏倚在－30%～40%范圍內(nèi)波動(dòng)，反映出免疫學(xué)方法的室間變異性明顯大于色譜質(zhì)譜法。

據(jù)CAP的結(jié)果報(bào)告顯示，截止到2015年共有超過(guò)400家實(shí)驗(yàn)室參加CAP的ABVD（Accuracy-Based Vitamin D）項(xiàng)目[11]。此項(xiàng)目提供來(lái)自于美國(guó)CDC的參考值。參評(píng)的實(shí)驗(yàn)室中，使用免疫學(xué)方法如Abbott Architect、DiaSorin Liaison Total、Roche cobas、Siemens Diagnostics等的實(shí)驗(yàn)室約占80%，分別為16.1%、15.1%、15.9%、22.5%；使用LC-MS/MS法的實(shí)驗(yàn)室占19.3%（60余家），且亦有逐年增加的趨勢(shì)。CAP自2013－2014年總共提供了12個(gè)室間質(zhì)評(píng)樣本，并從2015年開(kāi)始重新提供了這12個(gè)室間質(zhì)評(píng)樣本，同時(shí)在之前提供25OHD3、25OHD2的美國(guó)CDC參考值的基礎(chǔ)上，增加了3epi-25OHD3的結(jié)果。CAP所提供的25OHD項(xiàng)目的EQA樣本基質(zhì)，來(lái)源于數(shù)個(gè)捐獻(xiàn)者的新鮮冰凍血清，部分捐獻(xiàn)者抽血前服用維生素D2（采血經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)）。

CAP通過(guò)匯總室間質(zhì)量報(bào)告[11-12]得出如下結(jié)果：①不同的檢測(cè)方法結(jié)果均值與美國(guó)CDC的參考值相比，偏倚有明顯的差異，但總體而言LC-MS/MS法結(jié)果的偏倚最小，且不同EQA標(biāo)本間的偏倚變化也最小。②含有25OHD2的EQA樣本檢測(cè)結(jié)果，與美國(guó)CDC參考值的偏倚，高于不含25OHD2的EQA樣本的結(jié)果偏倚，這一變化在Abbott Architect、DiaSorin Liaison Total、Roche cobas法中體現(xiàn)的尤為明顯。

2 基于44例體檢者樣品的不同檢測(cè)方法25OHD結(jié)果可靠性分析

隨機(jī)選取2014年7月至2015年2月期間，在廣州金域體檢中心進(jìn)行體檢的44例健康體檢者，抽取全血各1.0 mL，置于－4℃保存。將同一體檢者的血清樣品，在同一天內(nèi)，分別采用LC-MS/MS法和Roche、Siemens兩種免疫學(xué)方法，進(jìn)行檢測(cè)及比對(duì)分析。其中本實(shí)驗(yàn)室的LC-MS/MS法經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證，并參與了DEQAS和CAP的EQA項(xiàng)目。

44份血清樣品檢測(cè)所用的儀器和試劑：API4000液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司）；Cobas e601全自動(dòng)免疫分析儀（羅氏公司）； ADVIA Centaur XP全自動(dòng)免疫分析儀（西門(mén)子公司）；Milli-Q Gradient 超純水機(jī)；雅培25羥基維生素D檢測(cè)試劑盒；羅氏總25羥基維生素D檢測(cè)試劑盒；甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克公司；25OHD2和25OHD3標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自西格瑪中國(guó)有限公司。

在收集體檢者樣本周期內(nèi)，LC-MS/MS方法EQA結(jié)果與對(duì)應(yīng)機(jī)構(gòu)提供的參考結(jié)果的分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和2。本實(shí)驗(yàn)室采用LC-MS/MS法檢測(cè)的25OHD結(jié)果與NIST和CDC結(jié)果偏倚在10%以內(nèi)，說(shuō)明所用LC-MS/MS方法的準(zhǔn)確度較好。

44份血清樣品基于本實(shí)驗(yàn)室3種檢測(cè)方法所得的檢測(cè)數(shù)據(jù)及偏倚分析情況見(jiàn)表3、圖1。圖1中圓圈標(biāo)識(shí)的是樣品中25OHD2的濃度＞10 ng/mL的檢測(cè)結(jié)果。由圖1可知，Roche和Siemens法的檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS法的差異較大，且不同的樣本基質(zhì)結(jié)果之間差異沒(méi)有規(guī)律可循，偏倚在－60%～30%不等。這一結(jié)果與DEQAS的結(jié)果“大部分的免疫學(xué)方法的結(jié)果與NIST結(jié)果相比偏倚在－30%～40%范圍內(nèi)波動(dòng)”相吻合；但在實(shí)際樣品檢測(cè)中，這一偏倚的波動(dòng)范圍更大。結(jié)合表2和圖1，Siemens的結(jié)果整體波動(dòng)性比Roche要大，且在大多數(shù)樣本中，呈現(xiàn)出比Roche結(jié)果偏倚更大的趨勢(shì)。圖1圓圈標(biāo)識(shí)的含有較高25OHD2的樣品的檢測(cè)結(jié)果，與LC-MS/MS法相比，偏倚并沒(méi)有呈現(xiàn)出更大的趨勢(shì)。這一結(jié)果與DEQAS和CAP的結(jié)論中25OHD2含量增加時(shí)，免疫學(xué)法結(jié)果與參考值偏倚更大的情況不相符。這可能是由于在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中，不同樣本基質(zhì)對(duì)免疫學(xué)法造成的影響，遠(yuǎn)大于25OHD2濃度增高所帶來(lái)的影響所致。而這一情況的存在，當(dāng)連續(xù)進(jìn)行25OHD治療的患者的血清基質(zhì)發(fā)生較大變化時(shí)，免疫學(xué)法可能無(wú)法正確反映治療方案的真實(shí)情況。

表 1 本實(shí)驗(yàn)室LC-MS/MS法25OHD結(jié)果與NIST結(jié)果比較分析

表 2 本實(shí)驗(yàn)室LC-MS/MS方法25OHD結(jié)果與CDC結(jié)果比較分析

圖1 基于臨床患者25OHD結(jié)果的Roche、Siemens與LC-MS/MS法的偏倚分析

表 3 44例體檢者標(biāo)本分別采用LC-MS/MS和Roce、Simens法檢測(cè)25OHD的結(jié)果比較分析

結(jié)合圖1和圖2綜合分析，Roche和Siemens法與LC-MS/MS方法的偏倚波動(dòng)范圍在檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)，遠(yuǎn)大于在EQA樣本檢測(cè)中的波動(dòng)范圍。這可能是由于EQA結(jié)果是基于多家實(shí)驗(yàn)室均值的比較，在一定程度上減弱了室間差異和基質(zhì)差異帶來(lái)的變異。同時(shí)從檢測(cè)結(jié)果可以看出，Roche和Siemens法與LC-MS/MS方法相比，結(jié)果變異性隨基質(zhì)的不同差異較大，尤其是Siemens法的偏倚在很多樣品中超過(guò)25%，甚至達(dá)到55%以上，這表明這兩種方法在部分樣本品檢測(cè)中，準(zhǔn)確度可能達(dá)不到要求。

圖2 基于EQA結(jié)果的Roche、Siemens與LC-MS/MS法的偏倚分析

由于所選取的44份樣品未有脂血狀況，所以未能驗(yàn)證DEQAS關(guān)于大部分免疫學(xué)方法對(duì)中度脂血樣結(jié)果偏低的結(jié)論；且本次LC-MS/MS法未能同時(shí)檢測(cè)24,25(OH)2D的結(jié)果，所以也未能反映和評(píng)估DEQAS關(guān)于在總 25OHD較高時(shí)，大部分免疫學(xué)方法樣本結(jié)果偏高的結(jié)論。同時(shí)隨機(jī)抽取的44例體檢者樣品的25OHD在29.4～65.2 ng/mL之間，基本落在25OHD的最佳濃度水平范圍內(nèi)，沒(méi)有覆蓋臨床較低濃度和較高濃度，因此研究結(jié)論可能存在一定的局限性。

綜上所述，在檢測(cè)血清25OHD時(shí)，采用免疫學(xué)方法，可能受基質(zhì)和25OHD體內(nèi)代謝物的影響較大，這一影響會(huì)因樣品基質(zhì)的復(fù)雜性而放大，且可能存在對(duì)某些樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度不夠的情況。而LC-MS/MS方法較免疫學(xué)方法，與NIST結(jié)果和CDC參考值的偏倚較小，且受基質(zhì)和25OHD內(nèi)源性待測(cè)物的影響較小，因此可靠性更好。

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doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.12.020

2016年廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201604020091)

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2017-07-03）

鄒 強(qiáng)）