葉曉琴 常國營 李 娟 丁 宇 李 牛 王 劍 王秀敏 沈亦平

1.安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院（安徽蚌埠 233000）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心（上海 200127）

兒童遺傳性果糖不耐受癥1例臨床和基因突變分析

葉曉琴1*常國營2*李 娟2丁 宇2李 牛2王 劍2王秀敏2沈亦平2

1.安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院（安徽蚌埠 233000）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心（上海 200127）

目的 分析遺傳性果糖不耐受癥（HFI）的臨床及基因突變特點。方法 回顧分析1例HFI患兒的臨床特征以及患兒及其父母的基因檢測結(jié)果?；驒z測采用高通量測序方法，并以Sanger測序進行驗證。結(jié)果 患兒，女，4歲3個月。表現(xiàn)為反復(fù)低血糖發(fā)作，明顯生長落后。病情穩(wěn)定時乳酸、尿微量蛋白稍高，甲狀腺激素、皮質(zhì)醇、糖化血紅蛋白、胰島素、C肽等無異常。腦電圖示癇樣活動?；驕y序顯示存在醛縮酶B基因（ALDOB）復(fù)合雜合突變，3號內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)剪切突變（c.325-1G＞A），8號外顯子移碼突變（c. 865delC;p.L289fs*10）；其父親攜帶移碼突變，母親攜帶剪切突變。結(jié)論 通過高通量測序技術(shù)，可確診由ALDOB突變致病的HFI。

靶向基因測序； 低血糖； 果糖不耐受； ALDOB基因； 基因突變

兒童低血糖（血糖＜3.9 mmol/L）可由眾多因素引發(fā)，除饑餓等生理因素外，包括1型糖尿病、2型糖尿病、新生兒糖尿病以及胰島素水平升高等病理因素均可誘發(fā)低血糖的發(fā)生，但仍有部分低血糖的發(fā)生原因不明[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，基因缺陷是低血糖發(fā)生的重要原因之一。目前共有270余種單基因突變的報道（人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫http∶//www.omim.org/）。遺傳性果糖不耐受癥（hereditary fructose intolerance，HFI）是一種糖代謝途徑酶缺陷誘發(fā)的以低血糖為主要癥狀的先天性遺傳病，該病患者若不能有效避免低血糖反復(fù)發(fā)作可能會繼發(fā)其他多器官系統(tǒng)異常，嚴重者可導(dǎo)致死亡。如何快速準確地進行病因診斷是臨床關(guān)注的焦點。現(xiàn)將1例通過靶向基因測序診斷的HFI的臨床診療過程及基因分析結(jié)果報告如下，以期提高臨床醫(yī)師對該疾病的認識。

1 臨床資料

患兒，女，漢族，上海兒童醫(yī)學(xué)中心初診年齡為4歲3個月。因反復(fù)低血糖2年余就診?；純喝朐呵?年反復(fù)發(fā)生低血糖，常在饑餓時發(fā)作，表現(xiàn)為大汗、精神差、昏昏欲睡，伴四肢抖動、雙眼上翻等，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院急診查血糖低，靜脈補充糖后可緩解。入院前3個月曾發(fā)生昏迷1小時，查血糖0.82 mmol/L，血鉀1.56 mmol/L，予靜脈補糖、鉀后好轉(zhuǎn)。入院前1個月來頻繁出現(xiàn)大汗、四肢抖動等低血糖癥狀?；純浩剿伢w質(zhì)差，易患上呼吸道感染，不喜甜食?；純篏1P1，足月剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量3 350 g，產(chǎn)時無窒息，母孕史正常?；純荷L發(fā)育較落后。父母否認近親結(jié)婚，家族中無類似疾病患者。體格檢查：腋溫36.8 ℃，脈搏99次/min，呼吸30次/min，血壓105/64 mmHg。身高 94 cm（－2.7 SD），體質(zhì)量 12 kg，體質(zhì)指數(shù)（BMI）為13.6 kg/m2；神清，反應(yīng)可，無特殊面容。心肺無殊。腹軟，肝臟肋下3 cm，劍突下2.5 cm，質(zhì)軟；神經(jīng)系統(tǒng)未見異常。實驗室檢查示血常規(guī)、糞常規(guī)、肝腎功能及電解質(zhì)正常；三酰甘油1.94 mmol/L（↑），血氨19 ?mol/L，乳酸3.00 mmol/L（↑）；甲狀腺功能、醛固酮、皮質(zhì)醇以及促腎上腺皮質(zhì)激素檢測均未見異常；空腹血糖4.8 mmol/L，胰島素8.7 ?IU/mL，C肽 1.61 ng/mL，糖化血紅蛋白（HbA1C）5.6%；尿常規(guī)示白蛋白+，尿微量白蛋白90.9 mg/L（↑）、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白7.00 mg/L（↑）、尿α1微球蛋白38.3 mg/L（↑）、尿IgG 11.20 mg/L（升高），24小時尿電解質(zhì)正常。腦電圖示左顳、兩枕區(qū)癇樣活動。心臟彩超示左房、左室稍增大。甲狀腺及腹部超聲正常。頭顱MRI平掃+增強未見異常。

經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會審查批準，并取得患兒父母知情同意后，采集患兒及其父母外周血2 mL，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝試管，充分混勻；取200 ?L全血，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit 試劑盒（Qiagen，德國）提取基因組DNA，用NanoDrop 2000 分光光度計對所提DNA 定量。

采用高通量測序進行致病基因鑒定。取3 ?g患兒的基因組DNA經(jīng)M220型核酸打斷儀（美國Covaris公司）處理后得到150～200 bp的DNA片段，采用SureSelect試劑盒（美國Agilent公司）制備測序文庫，捕獲探針為包含2 742個已知致病基因的Agilent Inherited Disease Panel 試劑盒（目標區(qū)域約為12 Mb）。經(jīng)2200 TapeStation儀器（Agilent，美國）對文庫樣本進行質(zhì)量及濃度檢測（確認雜交捕獲文庫的峰值為310～350 bp，濃度為2～20 mmol/L）。使用HiSeq 2500 System（Illumina，美國）進行高通量測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina Sequence Control Software（SCS）評估合格后，使用NextGENe軟件（美國SoftGenetics公司）進行數(shù)據(jù)讀取，讀取完畢后的數(shù)據(jù)上傳到美國Ingenuity Systems公司的Ingenuity Variant Analysis軟件進行生物信息學(xué)分析。Ingenuity軟件對變異篩選的參數(shù)包括：①去除測序質(zhì)量差、可信度低的變異；②去除正常對照人群數(shù)據(jù)庫（包括ExAC數(shù)據(jù)庫和千人基因數(shù)據(jù)庫）中頻率＞1%的變異；③去除“良性變異”，包括同義變異、經(jīng)PolyPhen-2 和 SIFT軟件預(yù)測為非有害的錯義變異以及經(jīng)MaxEntScan軟件預(yù)測不會改變mRNA剪切的變異；④以“低血糖（hypoglycemia）”為臨床指征篩選變異。結(jié)果顯示患兒存在ALDOB基因的復(fù)合雜合突變，其中3號內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)1個雜合剪切突變（c.325-1G＞A），8號外顯子存在1個雜合的移碼突變（c.865delC，p.L289fs*10），其中c.325-1G＞A為國內(nèi)外首次報道。

隨后以Sanger測序驗證ALDOB的基因變異。用于擴增ALDOB（GenBank序列號：NM_000035.3）基因的引物使用UCSC在線軟件（http：//genome.ucsc.edu/index.html）進行設(shè)計，針對ALDOB基因3號內(nèi)含子和4號外顯子區(qū)域的引物序列是：正向引物 5'-TGGGTCCCTCGCACTAATAC-3'，反向引物5'-AAACCAGGTACGTGTGGCTC-3'；針對ALDOB基因8號外顯子區(qū)域的引物序列是：正向引物5'-AACTAGCTTCAGCAAAAGCAAAC-3'，反向引物5'-TGACCTCTACTGCCACATTTTC-3'。使用rTaq DNA聚合酶（日本TaKaRa公司）進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳確認后使用QIAquick Gel Extraction Kit（德國Qiagen公司）進行純化，純化后的產(chǎn)物經(jīng)ABI3730XL測序儀（美國Applied Biosystems公司）Sanger測序，測序數(shù)據(jù)使用美國SoftGenetics公司Mutation Surveyor軟件進行分析。結(jié)果表明該患兒存在兩處雜合變異，其父親攜帶移碼突變而母親攜帶剪切突變（圖1A）。采用HSF以及MaxEntScan在線軟件對c.325-1G＞A的分析結(jié)果表明，該變異可破壞原有的剪切位點，從而導(dǎo)致ALDOB基因mRNA水平的異常剪切（圖1B）。使用Human Splicing Finder （HSF, http∶//www.umd.be/HSF3/HSF.html）和MaxEntScan (http∶//genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscanscoreseq.html)對ALDOB基因 c.325-1G＞A變異進行剪切位點影響評估，結(jié)果顯示c.325-1G＞A可破壞原有的剪切位點（HSF軟件的變異值為－32.84%，MaxEnt軟件的變異值為－112.63 %。HSF軟件的變異值＜－10%、MaxEnt軟件的變異值＜－30%判定為剪切位點破壞）。

圖1 患兒基因測序結(jié)果

確診HFI后，患兒每日睡前按5 g/kg加食生玉米淀粉以避免夜間饑餓，同時服用左卡尼汀、輔酶Q10及維生素等改善代謝，另外告知日常飲食杜絕攝入含果糖的食物?；純撼鲈汉蠖ㄆ陂T診隨訪，未再見低血糖發(fā)生，生長發(fā)育良好，復(fù)查尿常規(guī)及腎功能均正常，尿微量蛋白較前好轉(zhuǎn)。

2 討論

HFI是由果糖二磷酸醛縮酶（fruetaidolase，fructose-1,6-diphosphatealdolase）缺陷導(dǎo)致的代謝病，屬常染色體隱性遺傳，1956 年Chambers等[3]首次報道。發(fā)病率在英國約為1∶22 000、波蘭約為1∶31 000、歐洲中部約為1∶26 100，而中國人群的發(fā)病率未知[4]。該病臨床表現(xiàn)各異，其重要臨床特征為攝入果糖、蔗糖或山梨醇后發(fā)生嚴重低血糖。若不及時終止食入該類食物，患兒可發(fā)生肝、腎損傷及生長發(fā)育障礙，甚至死于進行性肝衰竭[5]。該病患兒年齡越小，癥狀越嚴重[6]。尤其是嬰兒期斷奶時，添加含果糖等食物可導(dǎo)致患兒喂食后20 ～ 30分鐘即可發(fā)生嘔吐、腹痛、昏迷等嚴重低血糖癥狀。多數(shù)患兒有拒甜食表現(xiàn)。實驗室檢查可有高轉(zhuǎn)氨酶血癥、高乳酸、低磷、高尿酸、高鎂血癥、蛋白尿、非特異性氨基酸尿、腎小管酸中毒等[7]。本例患兒以反復(fù)低血糖就診，平素不喜甜食，存在生長發(fā)育障礙，實驗室檢查示肝腎功能、電解質(zhì)等尚正常，尿蛋白+，尿微量蛋白升高，提示可能存在腎臟早期損傷。其腦電圖示癇樣活動可能繼發(fā)于低血糖。

HFI由ALDOB基因（OMIM#612724）突變導(dǎo)致。該基因位于9q31.1，由9個外顯子組成，其cDNA全長1 095 bp，編碼由364個氨基酸組成的B型醛縮酶[8]。醛縮酶是一種同源四聚體的同工酶，主要催化果糖-1,6-二磷酸與果糖-1-磷酸之間的醇醛分裂。人體內(nèi)存在3種組織特異性的醛縮酶：肌肉組織中的ALDOA，肝臟、小腸和腎臟組織中的ALDOB以及腦組織中的ALDOC[4]。HGMD數(shù)據(jù)庫共收錄了65個ALDOB基因的各類變異，包括錯義、無義、缺失、插入、剪接位點突變等，亦有啟動子區(qū)域突變報道[9,10]。目前尚無基因型與表型相關(guān)性報道，疾病嚴重程度與攝食情況、年齡、文化和飲食習(xí)慣密切相關(guān)。歐洲和北美患者中最常見的是A149P、 A174D和 N334K這三種突變[11]。中國人群中曾報道1例基因診斷明確的HFI患者存在ALDOB基因的純合突變(c.479-482delAACA)[12]。本例患兒基因測序顯示存在ALDOB基因的復(fù)合雜合突變（c.325-1G＞A和c.865delC, p.L289fs*10），其中c.325-1G＞A為首次報道，生物信息學(xué)分析表明其可破壞原有的mRNA正常剪切；c.865delC, p.L289fs*10已在HFI患者中報道過[13]，是已知的致病變異。因此該患兒確診為HFI。

本例患兒以不明原因低血糖為首發(fā)癥狀反復(fù)就醫(yī)，因較長時間無法明確診斷并采取有效預(yù)防措施，患兒出現(xiàn)不同程度繼發(fā)其他系統(tǒng)異常。糖代謝途徑涉及的酶學(xué)反應(yīng)及致病基因較多，僅從臨床表型難以確診。HFI這類肝臟代謝酶缺陷疾病的確診主要依靠肝臟活檢酶活性的測定和一些特殊檢測手段，如HFI還可采用果糖耐受實驗[14]。但這些方法創(chuàng)傷較大，存在一定程度的風(fēng)險，且檢測過程繁瑣，因此難以在臨床診斷中廣泛采用。近年來的研究表明，基因測序特別是高通量測序適用于這類遺傳代謝性病的診斷[15,16]。通過靶向基因測序，不僅使該例患兒在較短時間內(nèi)得到確診并接受有針對性的臨床干預(yù)和治療，同時也為再次生育提供產(chǎn)前咨詢和產(chǎn)前診斷的依據(jù)。此外，本研究可為先天性酶缺陷誘發(fā)反復(fù)低血糖的臨床診治提供借鑒思路。

目前對于HFI無根治方法，主要是對癥治療及飲食控制。一旦確診，需嚴格限制一切果糖、蔗糖或山梨醇等的攝入，避免低血糖發(fā)生。注意補充多種維生素，特別是水溶性維生素，防止微量元素缺乏。急性低血糖發(fā)作時主要給予葡萄糖靜滴及肝、腎功能不全輔助治療。并密切定期隨訪患兒肝、腎功能及生長發(fā)育等情況。

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The analysis of clinical manifestations and genetic mutations in a child with hereditary fructose intolerance

YE Xiaoqin1, CHANG Guoying2, LI Juan2, DING Yu2, LI Niu2, WANG Jian2, WANG Xiumin2, SHEN Yiping2(1.The Third People’s Hospital of Bengbu, Bengbu 233000, Anhui, China; 2.Shanghai Children’s Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200127, China)

Objective To analysis the clinical and gene mutation characteristics of hereditary fructose intolerance (HFI).Methods The clinical features and the results of gene testing in the child with HFI and her parents were analyzed retrospectively.Gene sequencing was carried out by high-throughput sequencing and validated by Sanger sequencing. Results The 4-year-3-month old girl had recurrent hypoglycemia episodes and growth retardation. When the condition was stable, the levels of lactic acid and urine micro protein were slightly higher, and the levels of thyroid hormone, cortisol, glycosylated hemoglobin, insulin and C peptide were normal. EEG showed epileptiform activity. Gene sequencing revealed the presence of aldolase B gene (ALDOB)compound heterozygous mutations, a novel splicing mutations (c.325-1G＞A) in intron 3 and a frameshift mutation (c. 865delC;p.L289fs*10) in exon 8. Her father carries a frameshift mutation, and her mother carries a splicing mutation. Conclusion The diagnosis of HFI caused by ALDOB mutation can be conf i rmed by high-throughput sequencing technology.

targeted gene sequencing; hypoglycemia; hereditary fructose intolerance; ALDOB gene; gene mutations

doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.12.002

李牛 電子信箱：liniu0509@163.com

*共同第一作者

2017-06-06)

蔡虹蔚)