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干血濾紙片類固醇激素質(zhì)控品制備及評價

2018-01-03 07:27韓連書邱文娟顧學(xué)范
臨床兒科雜志 2017年12期
關(guān)鍵詞:類固醇精確度內(nèi)源性

占 霞 韓連書 葉 軍 邱文娟 顧學(xué)范

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所小兒內(nèi)分泌/遺傳科(上海 200092)

干血濾紙片類固醇激素質(zhì)控品制備及評價

占 霞 韓連書 葉 軍 邱文娟 顧學(xué)范

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所小兒內(nèi)分泌/遺傳科(上海 200092)

目的 探討用于類固醇激素液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測,室內(nèi)質(zhì)控干血濾紙片(DBS)類固醇激素質(zhì)控品的制備方法。方法 收集全血,分離血細(xì)胞和血漿,生理鹽水洗滌血細(xì)胞,活性炭過夜吸附血漿,添加標(biāo)準(zhǔn)品,制成低、中、高三個濃度的DBS類固醇激素質(zhì)控品,LC-MS/MS檢測并分析其精確度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性及不同血斑間的差異。結(jié)果 DBS類固醇激素質(zhì)控品批內(nèi)精確度和準(zhǔn)確度分別為2.4%~7.0%,102.0%~111.0%;批間精確度和準(zhǔn)確度分別為5.1%~9.8%,99.0%~114.8%;-20℃保存5個月,月間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);不同血斑間變異系數(shù)為3.3%~8.2%,變異系數(shù)較小。結(jié)論 配制的DBS類固醇激素質(zhì)控品具有良好的精確度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性,血斑間差異小,符合室內(nèi)質(zhì)控品要求,可用于LC-MS/MS檢測類固醇激素的室內(nèi)質(zhì)控。

干血濾紙片; 類固醇激素; 質(zhì)控品; 串聯(lián)質(zhì)譜

類固醇激素的檢測在臨床疾病的診斷和治療中具有重要的作用。目前多采用熒光免疫分析法試劑盒進(jìn)行類固醇激素檢測,但一次試驗只能測定一種激素,且存在交叉反應(yīng)和基質(zhì)干擾[1,2]。國外部分實驗室以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatographytandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法測定血清及干血濾紙片(dried blood spots,DBS)中類固醇激素譜,用于先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia,CAH)的診斷、治療效果評價及二次篩查[3-6]。目前國內(nèi)外主要采用熒光免疫分析法測定新生兒DBS樣本17-羥孕酮(17-hydroxyprogesterone,17-OHP)水平作為新生兒CAH一級篩查方法,但存在較高的假陽性率,患兒的陽性預(yù)測值低[7]。采用LC-MS/MS法作為新生兒CAH二級篩查方法,測定DBS中類固醇激素譜,并考察酶反應(yīng)的底物與產(chǎn)物比值,可有效降低篩查假陽性[5-7]。上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所已經(jīng)建立了LC-MS/MS測定DBS中類固醇激素的方法。室內(nèi)質(zhì)量控制在臨床檢驗中至關(guān)重要,而良好的質(zhì)控品是室內(nèi)質(zhì)量控制的關(guān)鍵。然而目前國內(nèi)尚無廠商可提供LCMS/MS測定DBS中類固醇激素的試劑盒或質(zhì)控品,國外也無固定的供應(yīng)商。本研究采用自制的DBS類固醇激素質(zhì)控品,用于實驗室的室內(nèi)質(zhì)控,并對其性能進(jìn)行評價。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 DBS類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)品制備 收集健康成人全血50 mL,1 500×g離心5 min,分離血細(xì)胞及血漿。血細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次,儲存于4℃待用;血漿加入100 mg/mL活性炭,攪拌吸附過夜,60 000×g高速離心1 h去除活性炭,取上清液,重復(fù)一次。LC-MS/MS測定活性炭處理前、吸附一次后及吸附兩次后血漿中的內(nèi)源性類固醇激素含量。將血細(xì)胞及處理后的血漿按55∶45比例混合,以混合后的全血作為基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、10.000、50.000、200.000 ng/mL,將含標(biāo)準(zhǔn)品的全血滴至濾紙片上,濾紙片型號為S&S 903#,Whatman公司,制成一系列DBS標(biāo)準(zhǔn)品,晾干,-20℃保存待用。

1.1.2 DBS類固醇激素質(zhì)控品制備 以混合后的全血作為基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其終濃度分別0.8、25.0、150.0 ng/mL,分別制成低、中、高3個濃度水平的質(zhì)控品,晾干,-20℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)控樣品檢測方法 ①質(zhì)控樣品處理。直徑3.2 mm打孔器取樣2個DBS血斑,置于96孔過濾篩板中(濾膜0.45 μm,美國Millipore公司),每孔加入100 μL含0.5 ng/mL類固醇激素內(nèi)標(biāo)的甲醇/乙腈(容積1∶1,美國Fisher Scientific公司,質(zhì)譜級)萃取溶劑;37℃密封孵育震蕩50 min,970×g離心2 min,將萃取液離心至尖底96孔聚丙烯板(德國Greiner公司)中;50℃加熱氮氣吹干,50%甲醇70 μL復(fù)溶,鋁箔覆蓋,超高效液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(UPLC-Xevo-TQ-S,美國Waters公司)上樣檢測。②采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm),流動相A為H2O含2 mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸(美國Sigma-Aldrich公司);流動相B為MeOH含2 mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸;采用梯度洗脫:0~1 min,55%A;1~3.5 min,55%~35%A;3.51min2%A;5.0min,55%A;流速為0.45 mL/min。柱溫為40℃,進(jìn)樣體積為5μL。③在電噴霧電離陽離子檢測模式下,采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜模式采集數(shù)據(jù),霧化溫度450℃,離子源溫度150℃。類固醇激素的定量離子對分別為,雄烯二酮287.3/97.03(美國劍橋化學(xué)公司)、睪酮289.2/97.03(美國劍橋化學(xué)公司)、17-OHP 331.3/97.03(挪威Chiron公司)、孕酮315.3/97.03(美國劍橋化學(xué)公司)、11-脫氧皮質(zhì)醇347.30/109.07(挪威Chiron公司)、21-脫氧皮質(zhì)醇347.30/109.07(加拿大TRC公司)、皮質(zhì)醇363.3/121.1(美國劍橋化學(xué)公司)。7種類固醇激素定量檢測采用相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)曲線法,其中孕酮以D8-17-OHP(美國Cambridge Isotope Labs公司)為內(nèi)標(biāo),21-脫氧皮質(zhì)醇以11-脫氧皮質(zhì)醇-D2(美國Cambridge Isotope Labs公司)為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。

1.2.2 精確度測定 用變異系數(shù)(coefficient variation,CV)表示精確度,CV(%)=100×標(biāo)準(zhǔn)偏差/均值;采用低、中、高,3組干血濾紙片質(zhì)控品,對質(zhì)控品重復(fù)6次分析,計算6次的類固醇激素測定值的變異系數(shù)作為批內(nèi)變異;連續(xù)6天測定質(zhì)控品,計算6天的類固醇激素測定值作為批間變異。

1.2.3 準(zhǔn)確度測定 采用低、中、高3組干血濾紙片質(zhì)控品,對質(zhì)控品重復(fù)6次分析計算批內(nèi)準(zhǔn)確度,連續(xù)6天測定質(zhì)控品計算批間準(zhǔn)確度;準(zhǔn)確度的評價基于平均測定濃度與質(zhì)控品添加濃度的百分比,即準(zhǔn)確度(%)=100%實測值/參考值。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗 質(zhì)控樣品儲存于-20℃,每月檢測低、中、高質(zhì)控品,連續(xù)測定5個月,統(tǒng)計分析月間質(zhì)控品檢測值差異。

1.2.5 干血斑間變異系數(shù)分析 隨機選取低、中、高濃度的質(zhì)控品各10個不同的干血斑,每個血斑檢測3次,計算均值,標(biāo)準(zhǔn)差和CV(%),CV(%)≤15%方能達(dá)到檢測要求。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以百分比表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿內(nèi)源性類固醇激素測定

LC-MS/MS測定活性炭處理前、吸附一次后及吸附兩次后血漿中的內(nèi)源性類固醇激素含量。見表1。

2.2 質(zhì)控品DBS批內(nèi)精確度和準(zhǔn)確度測定

質(zhì)控品DBS的批內(nèi)精確度為2.4%~7.0%,批內(nèi)準(zhǔn)確度為102.0%~111.0%,見表2。

2.3 質(zhì)控品DBS批間精確度和準(zhǔn)確度測定

表1 LC-MS/MS測定活性炭吸附前后血漿中內(nèi)源性類固醇激素含量 (ng·mL-1)

質(zhì)控品DBS的批間精確度為5.1%~9.8%,批間準(zhǔn)確度為99.0%~114.8%,見表3。

2.4 穩(wěn)定性試驗

將質(zhì)控品DBS保存于-20℃,每月取出檢測,檢測5個月,月間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),穩(wěn)定性較好。見表4。

2.5 血斑間變異系數(shù)分析

質(zhì)控品不同血斑間變異系數(shù)分析見表5,不同血斑間CV%為3.3%~8.2%,變異系數(shù)較小。

3 討論

類固醇激素的測定在臨床診斷中至關(guān)重要。目前多采用熒光免疫分析法試劑盒進(jìn)行類固醇激素檢測,一次試驗只能測定一種激素,樣本量需要較多,需采用不同的試劑盒來完成不同類固醇激素的檢測,耗時長[1]。因血液中不同類固醇激素間結(jié)構(gòu)相似存在交叉反應(yīng)和基質(zhì)干擾,熒光免疫分析法靈敏度和特異性相對不高,檢測結(jié)果的假陽性率增加[2]。串聯(lián)質(zhì)譜法可檢測多種物質(zhì),具有快速、特異度和靈敏度高等優(yōu)點,國外一些實驗室已將該技術(shù)應(yīng)用于血清及DBS中類固醇激素譜的檢測,可用于先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的篩查和診斷[8-10]。

熒光免疫分析法測定新生兒DBS樣本中17-OHP水平是國內(nèi)外普遍采用的新生兒CAH一級篩查方法,但其存在較高假陽性率[7]。國際上較為公認(rèn)LC-MS/MS法作為新生兒CAH二級篩查方法,可測定DBS中類固醇激素譜,并考察酶反應(yīng)的底物與產(chǎn)物比值,有效降低篩查假陽性[5,6,8]。本實驗室已經(jīng)建立了LCMS/MS測定DBS中類固醇激素方法。

室內(nèi)質(zhì)量控制是保證結(jié)果準(zhǔn)確的重要手段,擁有良好的質(zhì)控品是做好室內(nèi)質(zhì)量控制的關(guān)鍵。然而目前國內(nèi)尚無LC-MS/MS測定DBS中類固醇激素試劑盒或質(zhì)控品銷售,而國外已建立此方法的實驗室也未指出有可購買的試劑盒或者商業(yè)化的質(zhì)控品。好的質(zhì)控品應(yīng)滿足:①較低的基質(zhì)效應(yīng);②至少有正常和異常兩個濃度水平;③較小的質(zhì)控樣本間差異;④穩(wěn)定期要較長;⑤無傳染性。

本實驗中收集全血后分離血細(xì)胞和血漿,血細(xì)胞利用生理鹽水洗滌,血漿通過活性炭吸附去除內(nèi)源性類固醇激素。處理后的血細(xì)胞及血漿按55∶45混合,添加不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品,將含類固醇激素的全血滴至干血濾紙片上,制成DBS類固醇激素質(zhì)控品。本研究評價了低、中、高三個濃度水平自制DBS類固醇激素質(zhì)控品的精確度、穩(wěn)定性及血斑間差異。批內(nèi)、批間精確度小于9.8%;質(zhì)控品保存于-20℃,連續(xù)5個月取出測定,結(jié)果顯示月間無顯著性差異,穩(wěn)定性較好;隨機選取10個不同的大血斑取樣檢測,變異系數(shù)CV<8.2%,血斑間差異較小;本研究制備了低、中、高三個濃度水平的質(zhì)控品,濃度分別為0.8、25.0、150.0 ng/mL,依據(jù)以往文獻(xiàn)報道,包含了正常和異常濃度水平[3,11]。綜上所述,自制的DBS類固醇激素質(zhì)控品能滿足上述要求。

表2 質(zhì)控品DBS批內(nèi)精確度和準(zhǔn)確度 (%)

表3 質(zhì)控品DBS批間精確度和準(zhǔn)確度 (%)

表5 質(zhì)控品DBS不同血斑間變異系數(shù)分析

表4 質(zhì)控品DBS穩(wěn)定性分析 (x±s,ng·mL-1)

因全血中含有內(nèi)源性類固醇激素,本實驗中分離血細(xì)胞和血漿,血細(xì)胞利用生理鹽水洗滌3次,血漿通過活性炭過夜吸附去除內(nèi)源性類固醇激素[3,12]。本實驗同時測定了活性炭處理前后血漿中內(nèi)源性類固醇激素含量并比較,結(jié)果顯示,經(jīng)兩次吸附后,血漿中內(nèi)源性類固醇激素含量大大降低,小于0.04 ng/mL或者儀器未檢出,表明使用活性炭吸附過夜能夠去除血漿中大部分的內(nèi)源性類固醇激素。目前國內(nèi)極少的實驗室建立了LC-MS/MS測定DBS中類固醇激素的方法,這可能與國內(nèi)尚無廠商提供DBS類固醇激素試劑盒或質(zhì)控品有關(guān)。

本研究自制的DBS類固醇激素質(zhì)控品,符合室內(nèi)質(zhì)控品的要求。鑒于目前國內(nèi)尚未有DBS類固醇激素質(zhì)控品供應(yīng),本研究制備的DBS類固醇激素質(zhì)控品可以提供給所需實驗室作為內(nèi)質(zhì)控使用,有助于LCMS/MS測定干血濾紙片中類固醇激素方法的推廣及應(yīng)用。

[1] Stanczyk FZ, Clarke NJ. Advantages and challenges of mass spectrometry assays for steroid hormones [J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2010, 121(3-5)∶ 491-495.

[2] Taylor AE, Keevil B, Huhtaniemi IT. Mass spectrometry and immunoassay∶ how to measure steroid hormones today and tomorrow [J]. Eur J Endocrinol, 2015, 173(2)∶1-12.

[3] Boelen A, Ruiter AF, Claahsen-van der Grinten HL, et al.Determination of a steroid profile in heel prick blood using LC-MS/MS [J]. Bioanalysis, 2016, 8(5)∶ 375-384.

[4] White PC. Neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia [J]. Nat Rev Endocrinol, 2009, 5(9)∶ 490-498.

[5] Choi JH, Kim GH, Yoo HW. Recent advances in biochemical and molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency [J]. Ann Pediatr Endocrinol Metab, 2016, 21(1)∶1-6.

[6] Sarafoglou K, Gaviglio A, Hietala A, et al. Comparison of newborn screening protocols for congenital adrenal hyperplasia in preterm infants [J]. J Pediatr, 2014, 164(5)∶1136-1140.

[7] White PC. Optimizing newborn screening for congenital adrenal hyperplasia [J]. J Pediatr, 2013, 163(1)∶ 10-12.

[8] Monostori P, Szabó P, Marginean O, et al. Concurrent confirmation and differential diagnosis of congenital adrenal hyperplasia from dried blood spots∶ application of a secondtier LC-MS/MS assay in a cross-border cooperation for newborn screening [J]. Horm Res Paediatr, 2015, 84(5)∶ 311-318.

[9] Rossi C, Calton L, Brown HA, et al. Confirmation of congenital adrenal hyperplasia by adrenal steroid profiling of filter paper dried blood samples using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Clin Chem Lab Med, 2011, 49(4)∶ 677-684.

[10] Kulle AE, Riepe FG, Hedderich J, et al. LC-MS/MS based determination of basal- and ACTH-stimulated plasma concentrations of 11 steroid hormones∶ implications for detecting heterozygote CYP21A2 mutation carriers [J]. Eur J Endocrinol, 2015, 173(4)∶ 517-524.

[11] Kim B, Lee MN, Park HD, et al. Dried blood spot testing for seven steroids using liquid chromatography-tandem mass spectrometry with reference interval determination in the Korean population [J]. Ann Lab Med, 2015, 35(6)∶578-585.

[12] Lin N, Zhang H, Qiu W, et al. Determination of 7-ketocholesterol in plasma by LC-MS for rapid diagnosis of acid SMase-deficient Niemann-Pick disease [J]. J Lipid Res,2014, 55(2)∶ 338-343.

Preparation and evaluation of dried blood spots control materials for steroids

ZHAN Xia, HAN Lianshu, YE Jun, QIU Wenjuan, GU Xuefan (Department of Pediatric Endocrinology and Genetics, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital Aff i liated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the preparation method of dry blood spots (DBS) control materials for steroids used for internal quality control by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Methods Whole blood was collected and the blood cells and plasma were separated. The blood cells were washed by saline. The activated charcoal was added to the plasma. Standard substance was added to make different concentrations (low, medium, and high) of DBS control materials for steroids. The precision, accuracy, stability, and differences among different blood spots were detected and analyzed by LC-MS/MS. Results The inter-day precision and accuracy of DBS control materials for steroids were 2.4%-7.0% and 102.0%-111.0%, respectively, and the intra-day precision and accuracy were 5.1%-9.8% and 99.0%-114.8% respectively. The DBS control materials for steroids were stored for 5 months, and there was no difference among the different months (P>0.05).The coeff i cients of variation among different blood spots were small, 3.3%-8.2%. Conclusions The DBS control materials for steroids has good precision, accuracy and stability. The difference among different blood spots is small and meet the requirements of indoor quality control products. They can be used for the internal quality control in steroids detection by LC-MS/MS.

dried blood spots; steroid hormones; quality control products; tandem mass spectrometry

doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.12.016

上海市衛(wèi)生局科研基金(No.2009210,20164Y0171);國家重點研發(fā)計劃(No.2016YFC0901505,2016YFC0905100)

韓連書 電子信箱:hanlianshu@xinhuamed.com.cn

2017-07-12)

鄒 強)

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