李哲馨，李萬峰，韓素英，齊力旺*

(1. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所細胞生物學實驗室，北京 100091；2. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091)

落葉松體細胞胚萌發(fā)能力研究

李哲馨1，李萬峰1，韓素英2，齊力旺1*

(1. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所細胞生物學實驗室，北京 100091；2. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091)

目的研究落葉松體細胞胚萌發(fā)能力，為落葉松在應用方面規(guī)?；敝程峁├碚撘罁?jù)。方法以落葉松體胚性細胞系S287的成熟體細胞胚為材料，區(qū)分了落葉松體細胞胚的不同子葉形態(tài)；進行樹脂切片及顯微觀察后，對其萌發(fā)能力進行了統(tǒng)計；并利用外源施用激素的方法研究了影響落葉松體胚再生成苗的重要因子。結果成熟的落葉松體細胞胚主要以四種形態(tài)存在，分別是正常子葉胚(NC≥4)，裂生子葉胚(2

落葉松；體細胞胚再生體系；萌發(fā)率；IAA

落葉松體細胞胚再生體系是研究裸子植物早期發(fā)育調(diào)控和形態(tài)發(fā)生的理想模式系統(tǒng)[1-2]。落葉松體細胞胚胎發(fā)生主要分為四個階段，分別是胚性愈傷組織的誘導階段、原胚團繼代與增殖階段、體胚誘導與成熟階段以及體胚萌發(fā)階段[3-5]。早在1990年，研究人員就利用歐洲落葉松(LarixdeciduasMill. )和日本落葉松(LarixleptolepisS. et Z. ) 的未成熟合子胚誘導出了胚性愈傷組織，而且接種時只選擇沒有附帶雌配子體組織的幼胚，這樣誘導出胚性愈傷組織的頻率是最高的[6]。隨后大量研究著眼于體細胞胚成熟產(chǎn)量和質(zhì)量[7-8]?；诼淙~松體胚發(fā)生同步化的不斷完善，研究人員已經(jīng)利用該體系進行了大量基因調(diào)控方面研究[3, 9-13]。盡管在之前的研究中已經(jīng)通過落葉松體細胞胚獲得了再生植株[6, 14-16]，但是對其再生能力尚沒有相關的探討。研究發(fā)現(xiàn)，外源施加生長素和赤霉酸可以促進進種子萌發(fā)[17-18]。在體細胞胚再生方面，外源施加GA3可加快百慕達草(Bermudagrass)體細胞胚萌發(fā)[19]。同時施用IAA與GA3可以提高葡萄體細胞胚萌發(fā)率[20]。但是相關研究主要集中在被子植物中，裸子植物落葉松中是否可以通過外源添加激素的方法改善其萌發(fā)狀況，需要進一步研究。

隨著植物組織培養(yǎng)技術不斷完善，對裸子植物體胚發(fā)生的研究已取得長足的進步。但研究人員研究的重點大多集中在前期體細胞胚誘導與成熟過程，對其后期萌發(fā)能力的探索亟待加強。本研究利用落葉松體細胞胚再生體系，觀察并分析了不同子葉形態(tài)的成熟落葉松體胚顯微結構，并對其生根能力進行了探索；利用外源施用激素處理方法研究了影響落葉松體胚再生成苗的重要因子。研究結果將為落葉松在應用方面規(guī)?；敝程峁┲匾茖W依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗采用日本落葉松胚性細胞系S287為實驗材料。在增殖培養(yǎng)基上進行原胚團繼代與增殖培養(yǎng)，在體細胞胚成熟培養(yǎng)基上進行體胚誘導與成熟[4]。外源施用GA3及IAA均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 不同子葉形態(tài)單胚觀察 將落葉松原胚團轉接到成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)45天后，分三批挑取共300個單胚(每批次隨機統(tǒng)計100個)進行統(tǒng)計，取平均值。在體式顯微鏡下進行形態(tài)觀察與拍照。

1.2.2 樹脂切片與觀察 將四種子葉形態(tài)的單胚置入FAA固定液(V(70%乙醇)∶V(甲醛)∶V(乙酸)= 9∶1∶1)中固定保存。對固定材料進行脫水、樹脂包埋與常規(guī)切片，經(jīng)甲苯胺藍 (TBO)染色后進行顯微觀察。

1.2.3 激素處理方法 選取發(fā)育良好的落葉松成熟體細胞胚，接種到分別添加了不同濃度的赤霉素GA3和生長素IAA的無菌萌發(fā)培養(yǎng)基上， 16 h/8 h光照條件下培養(yǎng)。20 d 后統(tǒng)計生根率，60 d后統(tǒng)計存活率。

2 結果與分析

2.1 落葉松體細胞胚存在不同子葉形態(tài)

表1 不同子葉形態(tài)落葉松體細胞胚所占比率及萌發(fā)率

2.2 各形態(tài)體細胞胚的顯微觀察

對上述不同子葉形態(tài)的落葉松體細胞胚進行樹脂切片與顯微觀察。發(fā)現(xiàn)，正常體細胞胚縱切結構細胞走勢明顯，莖端分生組織(SAM)向上隆起，子葉呈輻射對稱(圖1A)。裂生子葉胚的SAM則呈現(xiàn)非常微小的突起，從細胞走向仍可以確認其位置，但子葉不對稱且大小不一(圖1B)。與正常子葉胚相比，杯狀胚SAM完全呈現(xiàn)扁平狀，中間區(qū)域也沒有隆起，原中柱周圍細胞生長不對稱(圖1C)。三者的根端分生組織(RAM)沒有明顯差異。畸形胚則不能發(fā)育出完整的SAM和RAM(圖1D)。

SAM為莖端分生組織；RAM為根端分生組織；標尺長度為100 μm。SAM represent shoot apical meristem, RAM represent root apical meristem, scale bar represent 100 μm.圖1 落葉松不同形態(tài)體胚的顯微結構Fig.1 Microstructure of Different Morphology of somatic embryos in Larix leptolepis

2.3 各形態(tài)體細胞胚的生根情況

將成熟體細胞胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上5 d左右體細胞胚顏色變綠，10 d左右子葉伸展，20 d逐漸形成白色短根。分三批次隨機選取共300個成熟體胚(每次100個)進行萌發(fā)培養(yǎng)，對各形態(tài)落葉松體胚的生根率進行統(tǒng)計。結果發(fā)現(xiàn)，落葉松正常子葉胚的萌發(fā)為17.2%，裂生子葉胚生根率為12.4%，杯狀胚生根率約為5.7%，畸形胚在萌發(fā)培養(yǎng)基上不能生根，并很快死亡(表1)。

2.4 生長素IAA對落葉松體細胞胚生根的促進作用

本研究選取的落葉松胚性細胞系不易萌發(fā)，為進一步提高其萌發(fā)能力，選擇外源施用不同濃度的赤霉素GA3和生長素IAA處理發(fā)育良好的落葉松成熟體胚(表2)。培養(yǎng)20 d后對100個樣品統(tǒng)計生根率，60 d后統(tǒng)計存活率。結果發(fā)現(xiàn)，與未加任何激素處理相比，0.5 mg·L-1GA3處理的體胚生根能力較其它濃度而言提高了近三倍，但是培養(yǎng)兩個月后存活率僅為 13%，與對照差異不大。采用不同濃度IAA處理的體胚，以2 mg·L-1IAA處理結果最佳，其萌發(fā)率達到了56%，該濃度下體胚后期存活率仍能保持較高水平。在此基礎上，采用GA3和IAA最佳濃度組合處理，發(fā)現(xiàn)生根率和存活率并未增加，尤其是60 d后存活的幼苗由最初100個體胚減少到11株(表2)。

表2 不同激素處理落葉松體胚萌發(fā)率和存活率

3 討論

落葉松極難生根的特性限制了普通組織培養(yǎng)和扦插在落葉松快速擴繁中的應用。因此，體細胞胚胎發(fā)生成為優(yōu)良落葉松株系快速擴繁、人工種子研究及應用的主要途徑。本研究選擇的S287細胞系為不易萌發(fā)細胞系。其誘導的成熟體胚以四種子葉形態(tài)存在，其中正常體胚、裂生子葉胚和杯狀胚都具有萌發(fā)能力，但正常體胚顯然比后兩者生根能力略強這與之前的研究相一致[20]。顯微結構觀察結果顯示這種結構都發(fā)育出了較為完整的SAM，然而，裂生子葉胚和杯狀胚的SAM只有輕微隆起或完全呈現(xiàn)扁平狀，這可能是后期再生過程中影響體胚萌發(fā)的重要因素。在SAM中心區(qū)域，干細胞分裂產(chǎn)生兩部分細胞，一部分會始終保持在原來的位置，被稱為干細胞后羿(Progeny of stem cells)，另一部分則脫離中心區(qū)域到周圍分生組織區(qū)域，被稱為子細胞(daughter cells)[21]。與正常胚相比較，后兩者的SAM中心區(qū)域細胞走向和結構的改變(圖1)，進一步說明干細胞群的維持與周圍組織細胞提供的各類外源或內(nèi)源性信號分子密不可分。

三者的RAM 未見明顯差異，萌發(fā)能力上雖有較小波動，但是整體生根能力較弱。利用外源施用激素的方法處理體胚，發(fā)現(xiàn)2 mg·L-1IAA處理后體胚生根能力由11%增加到了56%(表2)。生長素對根部的形成具有重要促進作用。研究顯示，生長素向頂端分生組織運輸，在高生長素濃度區(qū)域形成器官原基[22]，KNOX基因的表達調(diào)節(jié)生長素極性運輸，因此，二者在根端干細胞的維持中存在一定的互作關系。生長素是維持根部分生組織的重要信號分子[23-25]。擬南芥中，生長素正向調(diào)控PLETHORA(PLT) 基因，后者對根端靜止中心(QC)和干細胞活性的維持具有重要作用[26]。SHORT-ROOT(SHR)和SCARECROW(SCR)基因?qū)Ω杉毎只哂兄匾{(diào)控作用。Homeobox(HB)家族的WUSCHEL(WUS)與CLAVATA(CLV)基因形成反饋調(diào)節(jié)環(huán)保持干細胞數(shù)量的恒定[22, 25]。因此，有必要利用分子生物學手段對影響四種形態(tài)胚生根能力的因子做進一步剖析。

事實上，影響體細胞胚萌發(fā)的因素很多，包括一系列內(nèi)源和外源因素。需要研究人員進一步挖掘。本研究對不同子葉形態(tài)的落葉松體細胞胚的萌發(fā)能力進行了統(tǒng)計，并利用外源施用激素的方法發(fā)現(xiàn)生長素IAA是落葉松體胚再生成苗且能保持存活的重要影響因子。在理論上，為研究裸子植物體細胞胚再生與基因功能研究奠定了良好的基礎，同時在實踐中，為落葉松在應用方面規(guī)模化繁殖提供重要科學依據(jù)。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，落葉松子葉數(shù)目不同的成熟體細胞胚其萌發(fā)能力各不相同，這可能是由于分生組織發(fā)育的差異造成的。通過不同濃度激素處理發(fā)育良好的落葉松子葉胚，發(fā)現(xiàn)2 mg·L-1IAA對落葉松體胚生根具有明顯的促進作用，說明IAA在落葉松體細胞胚萌發(fā)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

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GerminationAbilityofSomaticEmbryosinLarixleptolepis

LIZhe-xin1,LIWan-feng1,HANSu-ying2,QILi-wang1

(1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China;2. Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

ObjectiveGermination ability of somatic embryos inLarixleptolepiswas investigated to provide theoretical basis for large-scale breeding.MethodThe study was conducted by using mature somatic embryos (SEs) from embryonic cell line S287 ofL.leptolepisas the material. Four cotyledon shapes were distinguished and analyzed with resin sections method and microscopic observation. The rooting ability of the four types of SEs was calculated and the important factors that affect seedlings regeneration were identified with exogenous application of hormones.ResultFour types of mature SEs inL.leptolepiswere found in the investigation, i.e. the normal one with cotyledon number (NC) ≥ 4, the poorly separated-cotyledon one with 2

Larixleptolepis; somatic embryogenesis system; germination rate; IAA

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.016

2017-01-05

“十二五”國家高技術研究發(fā)展計劃(863)重點項目“白樺、落葉松轉基因育種技術研究”(2013AA102704)；國家自然科學基金重點項目“落葉松干細胞發(fā)育關鍵MicroRNAs功能分析及其TALE定向突變體創(chuàng)制”(31330017)。

李哲馨，博士生。主要研究方向：生物技術。E-mail：lizhexin_8903@163.com

* 通訊作者：齊力旺，研究員，博士生導師。主要研究方向：生物技術。E-mail：lwqi@caf.ac.cn

S791.223

A

1001-1498(2017)06-0999-05

張 研)