王美垚，唐永凱，俞菊華，徐 跑

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)，又名河蟹，其隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)、絨螯蟹屬(Eriocheir)，是一種在淡水中生長育肥、在海水中行生殖繁衍的洄游性甲殼類動物[1-3]。其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，被視為水產(chǎn)珍品，深受廣大消費(fèi)者的青睞。自20世紀(jì)70年代開始探索中華絨螯蟹的人工養(yǎng)殖，現(xiàn)今中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。中華絨螯蟹的人工養(yǎng)殖已成為我國淡水名特優(yōu)新品種養(yǎng)殖中的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和支柱行業(yè)，在推動我國淡水養(yǎng)殖生產(chǎn)持續(xù)健康地發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4-6]。中華絨螯蟹的生殖活動是我國河蟹人工養(yǎng)殖中的重要環(huán)節(jié)。探討河蟹在生殖階段機(jī)體的生理調(diào)控機(jī)制對于今后更好地促進(jìn)我國河蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 中華絨螯蟹生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

有關(guān)中華絨螯蟹生殖相關(guān)研究始于薛魯征、堵南山等開展的中華絨螯蟹雌雄生殖系統(tǒng)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及發(fā)育變化研究[7-8]。研究表明，中華絨螯蟹的雄性生殖系統(tǒng)包括一對精巢、射精管、輸精管、副性腺以及雄性生殖孔[9-10]。精巢的發(fā)育先于卵巢。河蟹的精巢通常于3月下旬初步具有較為完整的形態(tài)，精子的出現(xiàn)也先于發(fā)育成熟期的初級卵母細(xì)胞的出現(xiàn)。河蟹精巢的發(fā)育具有顯著的季節(jié)性特點[11]。在5—6月，為精巢初級發(fā)育期，副性腺等均不發(fā)達(dá)，成熟的精子較少；7—10月管腔充滿成熟精子，副性腺發(fā)達(dá)。10月至翌年4月，則是河蟹的生殖季節(jié)。4月后，精巢進(jìn)入休止期，逐漸出現(xiàn)退化[9-11]。薛魯征開展的河蟹雌性生殖系統(tǒng)組織學(xué)研究表明，其包括分葉卵巢、受精囊與輸卵管。河蟹的卵巢發(fā)育同樣具有明顯的季節(jié)性。大致包括三個階段：5—7月為發(fā)育延緩期，細(xì)胞中初級卵母細(xì)胞較多。8—11月為對數(shù)增長期，成熟前期的初級卵母細(xì)胞占據(jù)較大比例。12月至翌年4月為發(fā)育穩(wěn)定期[12-13]。

2 中華絨螯蟹生殖系統(tǒng)生化組成

配子質(zhì)量是動物生殖生物學(xué)研究的熱點話題。在中華絨螯蟹的研究上，對于雄性個體研究較少，但精子為后代提供了同等的遺傳物質(zhì)，精子的優(yōu)劣對卵子受精率及個體孵化率等具有直接影響作用。鑒于此，學(xué)者們開展了河蟹雄性生殖系統(tǒng)生化組成及精子代謝研究[14]，主要探討了生殖系統(tǒng)中主要能源物質(zhì)的分布模式及精子代謝關(guān)鍵酶，乳酸脫氫酶的活性。研究結(jié)果表明中華絨螯蟹能源代謝的關(guān)鍵物質(zhì)主要為蛋白質(zhì)以及脂類。碳水化合物為其精子代謝主要供能物質(zhì)，精子代謝方式以厭氧為主。而后王群又探討了河蟹雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中生化成分的季節(jié)變化[15]。結(jié)果表明，肝胰臟內(nèi)糖脂類物質(zhì)在性腺快速發(fā)育期以前經(jīng)由血淋巴轉(zhuǎn)移至精巢與副性腺。精巢對糖脂物質(zhì)的積累早于副性腺，同時這些物質(zhì)變化與生殖周期存在顯著相關(guān)性。

但鑒于有關(guān)河蟹雄性生殖系統(tǒng)生化組成研究是就其整體開展的，而未分別論述各部分的組成成分等。為進(jìn)一步開展河蟹雄性親本營養(yǎng)學(xué)研究及評價，麻楠等[16]就雄性親蟹生殖系統(tǒng)各部分包括精巢、副性腺、生殖管的生化組成、脂肪酸及氨基酸組成等開展了研究，結(jié)果表明，中華絨螯蟹雄性親蟹精巢中主要累積碳水化合物、脂肪多不飽和脂肪酸及高度不飽和脂肪酸。副性腺主要累積粗蛋白及大部分氨基酸。

3 生殖影響因素

3.1脂類物質(zhì)研究表明，動物的繁殖與性成熟親本營養(yǎng)狀況具有顯著相關(guān)性[17]。因而探討中華絨螯蟹營養(yǎng)需求對于更好開展其生殖調(diào)控、繁育優(yōu)質(zhì)幼體具有重要意義，因而學(xué)者們就此開展了相關(guān)研究。Wen等[18]探討了不同脂肪源飼料，包括魚油、豆油、豬油對河蟹繁殖力、孵化率以及卵脂肪酸組成的影響。結(jié)果表明投喂魚油飼料組的河蟹具有最高繁殖力與孵化率，同時卵內(nèi)多不飽和脂肪酸含量最高，因而在河蟹繁殖期應(yīng)提供充足的脂類物質(zhì)營養(yǎng)。而后劉立鶴等[19]開展了飼料中添加花生油、卵磷脂等不同脂肪源飼料對河蟹繁殖力、血淋巴卵黃蛋白原含量的影響。結(jié)果表明卵磷脂也可作為河蟹雌性親本飼料的優(yōu)質(zhì)脂肪源。

高度不飽和脂肪酸對于河蟹的發(fā)育與生殖具有較為重要的作用，它們是合成卵子正常發(fā)育與增殖所需物質(zhì)的基礎(chǔ)[20]，同時不同生物對不飽和脂肪酸需要量因物種而異。艾春香等[21]開展了HUFA對河蟹生殖性能的影響研究。研究結(jié)果表明，HUFA可有效提高雌蟹性腺中的抗氧化能力，是河蟹維持較優(yōu)的生殖性能的必需營養(yǎng)物質(zhì)。

Ji等[22]開展了投喂不同餌料包括縊蟶、沙蠶、野雜魚以及人工飼料對河蟹繁殖力、幼體質(zhì)量以及卵脂肪酸含量的影響研究。結(jié)果表明，二十碳五烯酸和高度不飽和脂肪酸對河蟹繁殖極為重要。Gong等[23]開展了脂肪酸結(jié)合蛋白在河蟹生殖季節(jié)中的克隆與表達(dá)研究，證實了脂肪酸結(jié)合蛋白在河蟹精巢快速生長期中的脂類運(yùn)輸作用，同時也證實了肝、精巢、卵巢以及血淋巴在脂類營養(yǎng)吸收與利用中所發(fā)揮的作用。

3.2維生素維生素是維持機(jī)體正常生理機(jī)能的營養(yǎng)物質(zhì)。水溶性維生素C具有良好的抗應(yīng)激與抗氧化功用，提高生物體性腺指數(shù)，最終有益改善親體的繁殖能力。膠原蛋白是生物體胚胎及個體早期發(fā)育中的關(guān)鍵物質(zhì)，而維生素C是膠原蛋白合成中的輔酶，能夠促進(jìn)賴氨酸和脯氨酸的羥基化，而這種作用能夠保證膠原蛋白維持未定的螺旋狀三級結(jié)構(gòu)，有益幼體發(fā)育[24]。維生素C通過影響河蟹性激素的合成進(jìn)而調(diào)節(jié)其生殖行為[25]。而河蟹自身無法合成只能依靠外源物質(zhì)供給[26]。探討維生素C對河蟹生殖的影響可更好指導(dǎo)親蟹生殖期人工飼料的研發(fā)。王群等[15]開展了添加維生素C對雄蟹繁殖的影響研究。研究結(jié)果表明，添加應(yīng)適度。適量添加可促進(jìn)性腺中維生素C的累積，進(jìn)而促進(jìn)精巢發(fā)育。繁殖期內(nèi)，河蟹性腺的抗氧化保護(hù)需要要強(qiáng)于肝臟等組織。

維生素E是一種脂溶性維生素，在親本發(fā)育，防止自由基的氧化破壞，進(jìn)而提高幼體成活率與后代孵化率上具有重要的抗氧化、抗應(yīng)激功用，同時對于產(chǎn)卵后的親本體質(zhì)復(fù)壯同樣發(fā)揮重要功用[27]。學(xué)者們因而又開展了維生素C、E對中華絨螯蟹生殖性能的影響研究[28]。研究結(jié)果表明，河蟹飼料中添加適量的維生素C與維生素E，可保護(hù)卵子中的脫氧核糖核酸不被破壞，提高受精卵的孵化率，可較好地改善河蟹生殖性能。

3.3色素類胡蘿卜素是一種重要的天然色素，動物自身無法合成，只能依靠外源營養(yǎng)物質(zhì)供給。類胡蘿卜素是維生素A的前體物質(zhì)，對胚胎發(fā)育具有較為重要的作用，同時在甲殼動物性腺發(fā)育期，類胡蘿卜素出現(xiàn)富集，可以維護(hù)營養(yǎng)物質(zhì)的貯存同時保護(hù)胚胎免受日光照射及氧化作用的影響[29]。劉立鶴等[19]開展了高度不飽和脂肪酸、β-胡蘿卜素、維生素E交互作用對中華絨螯蟹繁殖性能的影響研究。結(jié)果表明三者具有顯著的協(xié)同作用，對中華絨螯蟹的卵子質(zhì)量、生殖性能、非特異性免疫關(guān)鍵酶具有積極作用，可提高河蟹生殖性能與非特異性免疫力。

4 生殖調(diào)控機(jī)制

4.1眼柄外源的營養(yǎng)元素會對河蟹的生殖性能產(chǎn)生影響，同時，其生殖腺發(fā)育還會受到內(nèi)分泌系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)的直接調(diào)控。其中的腦、胸神經(jīng)節(jié)以及視神經(jīng)節(jié)均會對河蟹卵巢發(fā)育發(fā)揮調(diào)節(jié)功用。視神經(jīng)節(jié)X器官竇腺復(fù)合體可以分泌性腺抑制激素與蛻皮抑制激素，前者對卵巢發(fā)育產(chǎn)生直接抑制作用，后者則通過Y器官來間接抑制河蟹卵巢發(fā)育[30]。學(xué)者們在探討河蟹眼柄內(nèi)的視神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及神經(jīng)肽激素的調(diào)控機(jī)制中國發(fā)現(xiàn)河蟹眼柄內(nèi)的神經(jīng)肽因子對雌蟹卵巢發(fā)育具有重要的調(diào)控功用[31-33]。鑒于此，學(xué)者們開展了切除河蟹眼柄來探討其調(diào)控功能。研究表明，切除河蟹眼柄可以顯著促進(jìn)其性腺發(fā)育成熟，具體是由于切除眼柄后，可促使肝胰腺中的B細(xì)胞顯著增加，然而F細(xì)胞與R細(xì)胞數(shù)量則顯著下降，加速營養(yǎng)物向精巢進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而使精巢中的氨基酸含量增多，進(jìn)而為生殖腺的發(fā)育供給營養(yǎng)，促進(jìn)性腺發(fā)育成熟[34]。

4.2生殖調(diào)控基因除此之外，學(xué)者們還開展了中華絨螯蟹精巢、卵巢的比較轉(zhuǎn)錄組分析研究，更廣泛地挖掘中華絨螯蟹繁殖調(diào)控相關(guān)基因[35-36]。精子發(fā)生包括三個不同時期：精原干細(xì)胞有絲分裂，精原細(xì)胞減數(shù)分裂以及精子形成。每一時期都將會受到各種內(nèi)源基因的調(diào)控[37]。其中Jiang等[36]挖掘出了成熟雄蟹精巢中與生殖調(diào)控相關(guān)的基因包括熱休克蛋白70、vasa基因編碼蛋白、著絲粒軸基因、抗沉默因子1、Nuf2蛋白、富含絲氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)蛋白7、DMC1基因等。熱休克蛋白70在精子發(fā)生不同時期具有不同表達(dá)模式，主要調(diào)控細(xì)胞生長及分化[38]。睪丸增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄本是一種保守的細(xì)胞死亡抑制因子，在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[39]。富含絲氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)蛋白7可以調(diào)控剪切位點的選擇[40]。DMC1基因可以催化并促進(jìn)同源染色體重組[41]。Nuf2蛋白則可連接著絲粒至紡錘體[42]?？钩聊蜃?具有組氨酸伴侶活性，染色單體可經(jīng)由其連接至新合成的DNA分子[43]。王敏[35]開展的河蟹卵巢生殖相關(guān)基因的克隆及表達(dá)包括vasa、piwi、nanos及PL10基因。Piwi基因通過與一類和精子發(fā)生相關(guān)的microRNA的相互作用來對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，對于胚胎干細(xì)胞的維持、胚胎發(fā)育階段等發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[44]。Nanos基因?qū)τ诤有吩忌臣?xì)胞的形成和遷移是必需的[45]，nanos的缺失將會致使生殖干細(xì)胞項生殖腺的遷移失敗[46]。PL10則對精子發(fā)生過程的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。其參與精子的發(fā)生，主要在河蟹的胚胎發(fā)育階段發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

5 展望

生物的生殖發(fā)育調(diào)控機(jī)制一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。中華絨螯蟹是我國標(biāo)志性的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動物，河蟹養(yǎng)殖業(yè)也已成為我國名特優(yōu)新品種養(yǎng)殖中的支柱性產(chǎn)業(yè)。探討河蟹的生殖發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制對于今后河蟹種質(zhì)改良，更好地推動中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的理論意義及現(xiàn)實意義?？v觀現(xiàn)今開展的河蟹生殖發(fā)育調(diào)控研究，多是集中在河蟹親體的營養(yǎng)生理學(xué)方面，飼料中脂類、氨基酸物質(zhì)等的影響方面，也初步開展了河蟹眼柄生殖調(diào)控相關(guān)基因的分子生物學(xué)研究。河蟹生殖調(diào)控基因及通路的研究是今后開展河蟹生殖調(diào)控、品質(zhì)提升的必備信息，今后應(yīng)加大該方面的研究，采用高通量測序等先進(jìn)技術(shù)手段，探討雌雄個體、繁殖期不同階段等的差異調(diào)控通路，挖掘關(guān)鍵調(diào)控通路及基因，為最終揭示中華絨螯蟹生殖調(diào)控分子機(jī)制，更好的促進(jìn)我國河蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展貢獻(xiàn)力量。