韓永光，馬利剛，趙 樂(lè)，馮衛(wèi)生，鄭曉珂*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450046)

病程相關(guān)基因非表達(dá)子1 ( nonexpressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)是多個(gè)抗病性信號(hào)傳導(dǎo)通路的交叉點(diǎn)，是調(diào)節(jié)植物整體抗病性的重要作用因子，又稱為NIM1 或SAI1。植物如果缺少NPR1的功能，就會(huì)導(dǎo)致病程性相關(guān)蛋白質(zhì)PR基因表達(dá)的受損和在應(yīng)對(duì)病蟲害侵害時(shí)，系統(tǒng)性獲得抗性 (Systemic Acquired Resistance，SAR)的抵抗作用幾乎全部缺失。通過(guò)對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示NPR1啟動(dòng)子中含有相對(duì)保守的28個(gè)核苷酸序列，這些序列組成3個(gè)W盒，其中1個(gè)反向排列，2個(gè)順向串聯(lián)。NPR1啟動(dòng)子必需與WRKY蛋白結(jié)合后才能發(fā)揮作用，如果W盒中的某個(gè)核苷酸被替換，則不能與WRKY 蛋白發(fā)生結(jié)合[1]。NPR含有多個(gè)錨蛋白重復(fù)序列和1個(gè)BTB/POZ區(qū)，NPR1在細(xì)胞核內(nèi)主要是負(fù)責(zé)SA-介導(dǎo)PR-1基因的誘導(dǎo)表達(dá)，而其在細(xì)胞溶質(zhì)中主要在SA和JA信號(hào)通路中發(fā)揮重要的拮抗作用[2]。

在細(xì)胞溶質(zhì)中NPR1通過(guò)氨基酸順序的第82和216位半胱氨酸殘基分子間的二硫鍵結(jié)合形成寡聚體，可通過(guò)硫氧還蛋白H5或H3還原2個(gè)半胱氨酸殘基(Cys82和Cys216)調(diào)控細(xì)胞液中的氧化還原狀態(tài)，NPR1低聚物二硫鍵迅速被還原, 形成單體。NPR1單體隨后由細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在核中激活防御基因的轉(zhuǎn)錄。突變這2個(gè)半胱氨酸中的任何一個(gè)都能導(dǎo)致核定位單體NPR1水平的升高，而核定位單體NPR1與不斷上調(diào)PR基因的表達(dá)密切相關(guān)[3]。

1 NPR家族

最新研究表明NPR蛋白家族包括研究相對(duì)多的NPR1和另外5個(gè)可能編碼NPR 1相關(guān)基因(NPR2-6)，其共同點(diǎn)是均含有保守BTB / POZ、錨蛋白的相關(guān)蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域和高度保守半胱氨酸殘基。NPR3是免疫信號(hào)SA的受體，可作為泛素E3配體的調(diào)節(jié)器，以一種SA調(diào)節(jié)的方式調(diào)控npr1的降解。npr3突變體積累了較高水平的npr1，對(duì)SAR誘導(dǎo)不敏感。該突變體在病原體效應(yīng)誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡和免疫方面存在缺陷[4]。NPR4與NPR1具有36%的同源性，并與轉(zhuǎn)錄因子TGA相互作用。NPR4 mRNA水平的表達(dá)量會(huì)隨病原體的侵入和SA的處理而激增，但JA的處理則會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)水平的下降， NPR4主要在抗病原體的基礎(chǔ)防御起到必需的作用，而且它可能與SA和JA依賴的信號(hào)通路之間的交叉通路有關(guān)[5]。NPR5又稱為BOP1 ，BOP1能編碼一個(gè)具有錨蛋白重復(fù)序列的BTB/POZ 域的蛋白。BOP1屬于一類小基因家族成員，其中包括比較典型的抗病調(diào)節(jié)蛋白NPR1。 BOP1在調(diào)控葉片形態(tài)形成和分化起關(guān)鍵作用[6]。NPR6又被稱為BOP2，BOP2同樣能調(diào)節(jié)葉片的發(fā)育，最新研究表明BOP2能通過(guò)減少PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4(PIF4)蛋白水平，促進(jìn)光生形態(tài)的形成，并通過(guò)抑制PIF4活性來(lái)調(diào)節(jié)熱形態(tài)發(fā)生[7]。NPR2功能研究尚不清楚，有文獻(xiàn)表明NPR2與NPR1序列相似性高，功能類似，同樣對(duì)SA比較敏感[8]。

2 NPR的抗性

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段將NPR1基因轉(zhuǎn)入到擬南芥突變體npr1后，突變株不僅能在表型上有所改觀，其SAR的能力也得到恢復(fù)，PR基因的表達(dá)和植物的抗性能力得到增強(qiáng)。即使在無(wú)誘導(dǎo)的條件下，同樣具有很強(qiáng)的抗性能力[9]。有文獻(xiàn)表明在NPR1基因的過(guò)量表達(dá)植株具有增強(qiáng)植物的抗病能力，且無(wú)其他不良的負(fù)效應(yīng)[10]。Chern等[11]在過(guò)量表達(dá)擬南芥NPR1基因的水稻中證實(shí)NPR1基因在單子葉植物中所扮演的作用，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻植株能提高對(duì)水稻細(xì)菌性枯葉病原體的抗性能力，而且RNA點(diǎn)雜交試驗(yàn)表明NPR1基因的高表達(dá)能提高抗病能力，首次確定NPR1基因可以提高單子葉植物的抗病能力。而過(guò)量表達(dá)NPR1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻中則能夠顯著地增強(qiáng)植株抗病性，結(jié)果表明NPR1是SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中作用于SA下游的一個(gè)關(guān)鍵性調(diào)控因子。在SAR誘導(dǎo)條件下，擬南芥npr1突變體能積累正常的SA濃度, 但是不能有效地激活SAR，更不能積累PR蛋白，從而不能高效地提高植物的抗性，npr1突變體表現(xiàn)為對(duì)病原體更加敏感，使抗病R基因參與形成的抗病能力得到降低，表明NPR1在感染位置限制病原菌生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用。

荷蘭科學(xué)家Pieterse等[12]發(fā)現(xiàn)NPR1同樣在誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance,ISR)中具有重要的作用。在npr1突變株中，ISR不能被ISR誘導(dǎo)菌Pseudomonas fluorescens誘導(dǎo)激發(fā)。經(jīng)過(guò)SA和JA同時(shí)處理植株葉片后，SA能抑制JA相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)，但在NahG轉(zhuǎn)基因植株侵染PstDC3000后，SA的含量沒(méi)發(fā)生明顯地變化，而JA水平卻增加了25倍，參與JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的相關(guān)基因表達(dá)量也顯著地增強(qiáng)，在npr1突變體的植株中, 這種抑制作用顯著減弱[2]。說(shuō)明NPR1在SA介導(dǎo)的SAR和JA介導(dǎo)的ISR中均具有重要免疫調(diào)節(jié)作用。在jar和etr突變體中ISR防御生理過(guò)程受抑制，結(jié)果表明ISR過(guò)程需要JA和C2H4等信號(hào)參與。生態(tài)型為RLD和Ws的擬南芥中ISR受到抑制，使得擬南芥對(duì)C2H4的刺激不敏感。而eds4和eds8突變體分別對(duì)C2H4和JA的處理不敏感，ISR生理過(guò)程反應(yīng)也受到抑制。但另一種eds的突變體eds10對(duì)C2H4和JA均能做出免疫反應(yīng)，進(jìn)而能激活SAR反應(yīng)，但不能激活I(lǐng)SR反應(yīng)。表明EDS10是ISR中一個(gè)很重要的作用因子。在整個(gè)ISR反應(yīng)過(guò)程中，同時(shí)還需要位于JAR1和ETR1下游的NPR1的參與[12]。因此，可以證實(shí)NPR1是誘導(dǎo)SA或JA/C2H4防衛(wèi)反應(yīng)的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。而大量試驗(yàn)表明SA的積累會(huì)導(dǎo)致JA的生物合成和JA調(diào)節(jié)基因表達(dá)的抑制。對(duì)野生型和SA、JA和C2H4缺失的突變體進(jìn)行大規(guī)模研究分析發(fā)現(xiàn)，盡管SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能被JA/C2H4抑制，但SA對(duì)JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制更為普遍[13]。另外發(fā)現(xiàn)用SA和JA處理擬南芥可以抑制JA調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)[2]，而對(duì)npr1突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)SA對(duì)JA的拮抗效應(yīng)需要NPR1參與。與激活SAR不同，NPR1不參與抑制JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，可以說(shuō)NPR1是植物防御免疫反應(yīng)(包括SAR、ISR、SA/JA 交叉轉(zhuǎn)導(dǎo))的關(guān)鍵調(diào)控因子。

趙利輝等[14]從多種病原真菌中分離純化出一種新的42 kD耐熱蛋白，被稱之為植物激活蛋白(plant activator protein)，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)TMV和CMV等多種植物病菌都具有一定的抗性。cDNA芯片試驗(yàn)表明該蛋白可誘導(dǎo)NPR1和乙烯受體相關(guān)基因等抗病基因的轉(zhuǎn)錄，他們檢測(cè)該激活蛋白處理水稻葉片能引起水稻NPR1的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，促進(jìn)抗病蛋白如PR蛋白的積累，提高其抗性。說(shuō)明植物體內(nèi)某些熱激蛋白也可能與NPR1發(fā)生相互作用。npr1突變體植株對(duì)SAR多種誘導(dǎo)介質(zhì)如SA、INA均不能明顯作出抗性應(yīng)答, 表現(xiàn)為PR基因的表達(dá)幾乎無(wú)明顯變化，而且更容易感染細(xì)菌和真菌病毒等病菌。而使用外源性SA 或人工合成的類似物質(zhì)，例如IN A可使PR基因的表達(dá)得到誘導(dǎo)和可較強(qiáng)地激活SAR[15-16]。另外有研究發(fā)現(xiàn)NPR1基因不僅在SA介導(dǎo)的SAR以及根圍細(xì)菌介導(dǎo)的ISR中具有重要作用, 而且在抑制JA信號(hào)分子介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)方面也發(fā)揮著重要作用。

盡管在NPR1蛋白的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)由SA 介導(dǎo)SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑大多為NPR1蛋白依賴型，然而有研究發(fā)現(xiàn)存在一種不依賴于NPR1蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)途徑?？剐詳M南芥生態(tài)型Di-17植株感染蕪菁卷曲病毒(TCV)后，證實(shí)HR的形成和對(duì)TCV 抗性均依賴于SA途徑，而非依賴于乙烯和茉莉酸， 并且NPR1 基因突變不能影響這些生理過(guò)程，表明擬南芥的TCV抗性存在一條仍未確定的依賴SA而不依賴NPR1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[17]。在煙草研究證實(shí)TMV抗性是由一條依賴于SA似乎還需要交替氧化酶( Alternative Oxidase, AOX) 的介導(dǎo)途徑的，奇怪的是SHAM(一種AOX活性的抑制物質(zhì))可抑制TMV抗性，而不能抑制PR表達(dá)的TMV誘導(dǎo)性的激活抗性, 另外細(xì)菌或真菌病原體的抗性并不會(huì)受到SHAM處理的影響。因此，煙草中可能存在至少2條不同的SA調(diào)控防御途徑: 一條認(rèn)為是依賴于NPR1且調(diào)控PR基因的表達(dá)以及抗細(xì)菌和病原體;而另一條可能是不依賴于NPR1也能激活病原體抗性[18-19]。Bowling等[20]篩選出來(lái)的擬南芥cpr突變株存在2種調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑——依賴NPR1和不依賴NPR1的SAR途徑的組成表達(dá)，這種現(xiàn)象說(shuō)明這2種調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在早期的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程是相互關(guān)聯(lián)的，而且在病毒抗性方面可能存在重疊效應(yīng)。

3 NPR與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用

酵母雙雜交試驗(yàn)表明與NPR1直接相互作用的蛋白主要是bZIP轉(zhuǎn)錄因子的TGA家族的多個(gè)成員，還有就是其他3種蛋白NIMIN1，2和3(NIM1-相互作用蛋白1，2和3)[21]。Zhang等[22]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)NPR1 能與TGA 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用，從而調(diào)節(jié)NPR1的表達(dá)。NPR1上4個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的任何一個(gè)發(fā)生突變，均能導(dǎo)致NPR1 不能與TGA發(fā)生作用。而這種相互作用是調(diào)節(jié)PR基因表達(dá)所必需的，說(shuō)明NRP1可能通過(guò)TGA調(diào)控PR基因的表達(dá)和增強(qiáng)植物的抗病能力。TGA轉(zhuǎn)錄因子是b ZIP轉(zhuǎn)錄因子家族非常重要的組成部分，其含有DNA結(jié)合域和亮氨酸拉鏈，能與順式作用元件相結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)[23]。雖然在經(jīng)過(guò)SA處理后，擬南芥中NIMIN1，2和3被誘導(dǎo)的相對(duì)持續(xù)時(shí)間較短，但NIMIN1表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控SA/NPR1信號(hào)通路。過(guò)量表達(dá)NIMIN1導(dǎo)致ETI和SAR的鈍化效果。而減少NIMIN1的表達(dá)則PR-1基因的表達(dá)能通過(guò)SA得到增強(qiáng)[24]。在酵母中，NPR1可與5個(gè)不同的擬南芥TGA因子相互作用，而在高等植物中NPR1可與7個(gè)不同的擬南芥TGA因子相互作用[25]，而在經(jīng)過(guò)SA處理的擬南芥葉片中，僅檢測(cè)到TGA1和TGA4與NPR1相互作用。這種相互作用依賴于SA誘導(dǎo)的氧化狀態(tài)環(huán)境的變化，從而導(dǎo)致TGA1和TGA4 2個(gè)特有的半胱氨酸殘基Cys-260 和Cys-266的還原。在非誘導(dǎo)情況下, 這2個(gè)氨基酸殘基以氧化狀態(tài)存在, 以二硫鍵結(jié)合, 防止與NPR1 結(jié)合；當(dāng)SA處理誘導(dǎo)后, 二硫鍵被還原，使得TGA蛋白與NPR1相互作用，從而激活基因表達(dá)，增強(qiáng)抗性[26]。在無(wú)SA存在的情況下，TGA2也能與NPR1相互作用，但在SA處理葉片中，這一相互作用可增強(qiáng)[27]。然而，TGA2和TGA3激活抗病基因轉(zhuǎn)錄需要SA和NPR1。因?yàn)镹IMIN1在酵母中能與TGA2、TGA6、NPR1和PR-1啟動(dòng)子區(qū)域形成復(fù)合體，這一復(fù)合體可能調(diào)控TGA依賴的SA調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄激活[24]。

4 展望

NPR1是植物抗病性的關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，涉及多種抗性途徑，現(xiàn)已知在多種經(jīng)濟(jì)作物中均含有NPR1或高度同源的基因，在植物保護(hù)中具有重要的研究?jī)r(jià)值，因此可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)工程手段將NPR基因應(yīng)用于植物保護(hù)等方面，在植物抗病害等方面應(yīng)用前景廣闊。實(shí)際上，科學(xué)家已經(jīng)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因NPR1擬南芥和水稻等植物，對(duì)它們?cè)诳剐苑矫娴难芯恳踩〉弥匾某煽?jī)。很多研究表明過(guò)量表達(dá)NPR1的單子葉或雙子葉植株均表現(xiàn)出對(duì)多種致病病原體具有良好的抗性，因此在減少植物病害、增加作物產(chǎn)量方面，NPR1具有巨大的應(yīng)用潛力和研究?jī)r(jià)值。如通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，特異性高誘導(dǎo)NPR1的表達(dá)激活植物防御機(jī)制，誘導(dǎo)植物抗性。通過(guò)篩選、分離和鑒定植物的抗病突變體。同時(shí)，還可以篩選一些能夠激活植物SAR的小分子化合物；盡管科學(xué)界對(duì)NPR1的研究取得很大的進(jìn)展，但是仍然有許多問(wèn)題還沒(méi)有得到解決，如：SA激活NPR1基因表達(dá)是否涉及其他代謝分子，還需要進(jìn)一步深入研究；不同TGA轉(zhuǎn)錄因子成員如何互相協(xié)調(diào)共同調(diào)控NPR1信號(hào)傳導(dǎo)途徑；NPR1如何在植物體內(nèi)有機(jī)地調(diào)控不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，將涉及SA、ET和JA的信號(hào)之間有機(jī)聯(lián)系在一起；NPR1和SA等信號(hào)途徑之間是否還存在其他不同的調(diào)控因子；NPR1結(jié)合蛋白與NPR1的相互作用機(jī)制尚不完全清楚；通過(guò)分子生物學(xué)、基因工程等多種技術(shù)手段，應(yīng)該能夠獲取更多與NPR1相互作用的因子或調(diào)節(jié)基因，有助于對(duì)NPR1作用機(jī)理的了解， 為進(jìn)一步研究植物抗病防治機(jī)制做貢獻(xiàn)。