鄭 露，蔣業(yè)林*，程云生，侯冠軍，王 芬，季索菲，王佳佳，李 翔

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，安徽合肥 230031；2.安徽省鱉類(lèi)良種繁育與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233000，3.安徽省喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽蚌埠 233000)

中華鱉(Pelodiscussinensis)隸屬于爬形綱龜鱉目，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是我國(guó)廣為分布和養(yǎng)殖的名貴食用水產(chǎn)動(dòng)物[1]。近年來(lái)，我國(guó)中華鱉人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，但病害卻十分嚴(yán)重，控制傳染病的發(fā)生和蔓延，對(duì)提高養(yǎng)鱉效益、降低生產(chǎn)成本尤為重要。在中華鱉實(shí)際生產(chǎn)和科研探索歷程中，發(fā)現(xiàn)中華鱉雄性個(gè)體比雌性個(gè)體生長(zhǎng)速度快，裙邊厚實(shí)，膠原蛋白豐富，發(fā)病少，養(yǎng)殖成活率高，不管是養(yǎng)殖戶(hù)還是消費(fèi)者更加青睞于雄性中華鱉的養(yǎng)殖和食用。因此，在生產(chǎn)中提高中華鱉的雄性率對(duì)于推動(dòng)中華鱉產(chǎn)業(yè)更快更好地發(fā)展具有重要意義。

有關(guān)爬行類(lèi)的單性控制，國(guó)外學(xué)者曾做過(guò)一些研究，Bull[2]報(bào)道，爬行類(lèi)中有些種類(lèi)的性別決定與孵化溫度密切相關(guān)。國(guó)外研究成果中也涉及到多種性激素對(duì)龜鱉類(lèi)性別控制技術(shù)的報(bào)道，Bentley[3]指出雌性黃喉水龜血漿中的雌二醇含量在產(chǎn)卵前后期處于波動(dòng)狀態(tài)，含量較高時(shí)出現(xiàn)在產(chǎn)卵前，含量較低時(shí)出現(xiàn)在剛產(chǎn)完卵和產(chǎn)卵后期。卵產(chǎn)出后，卵巢內(nèi)的卵泡逐漸變大，血漿中的雌二醇含量隨之升高。說(shuō)明雌二醇能夠刺激黃喉水龜卵的發(fā)育，促進(jìn)卵的成熟。

國(guó)內(nèi)有關(guān)中華鱉的性別控制研究的報(bào)道中，溫度和外源激素是常用于中華鱉性別分化調(diào)控的關(guān)鍵因子，而外源激素中的雌二醇、甲基睪丸酮、芳香化酶抑制劑是研究最多的激素種類(lèi)。通過(guò)對(duì)最新相關(guān)研究文獻(xiàn)綜述，并對(duì)有關(guān)技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行分析，以指導(dǎo)中華鱉高雄性人工誘導(dǎo)技術(shù)在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用，促進(jìn)該產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效率的提高。

1 中華鱉高雄性率研究

1.1孵化溫度孵化溫度對(duì)于大部分魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)動(dòng)物的性別分化和性腺發(fā)育影響顯著，大多數(shù)龜鱉目動(dòng)物都具有溫度依賴(lài)型性別決定(temperature-dependent sex determination，TSD)，溫度對(duì)影響中華鱉孵化和發(fā)育的作用很大，具體表現(xiàn)在孵化溫度可以決定稚鱉的性別比例、影響孵化周期的長(zhǎng)短和孵化率的高低[4]。

針對(duì)溫度對(duì)于中華鱉性別分化等的影響方面，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都做了大量研究。羅曼等[5]認(rèn)為孵化溫度在(27～29)±0.5 ℃，分期前保持濕度85%，孵化率可以達(dá)到95%以上，并且在24～26 ℃時(shí)，孵化出來(lái)的個(gè)體中雄性和雌性的比例大于1，溫度在26.0～27.5 ℃時(shí)，孵化出來(lái)的個(gè)體中雄性和雌性的比例小于1。阮成旭等[6]在32 ℃條件下孵出的雄性比例為64.1%，32 ℃孵化出的雌性比例是34.3%，與聶劉旺等[7]的結(jié)論和以上結(jié)果相差無(wú)幾，認(rèn)為在29 ℃孵化下性別比例接近1∶1。巫旗生等[8]研究發(fā)現(xiàn)，中華鱉在32 ℃孵化雄性率高，27 ℃孵化雌性率高。

目前，關(guān)于孵化溫度對(duì)中華鱉性別分化的影響仍然有爭(zhēng)議，就溫度在32 ℃情況下中華鱉雄性率的研究結(jié)果也有差異。任少亭等[9]在該溫度下雄性孵化率為85%，朱道明等[10]認(rèn)為同溫度下雄性孵化率為88%。也有部分研究認(rèn)為，鱉卵孵化有2個(gè)極限溫度，孵化溫度在<26 ℃和>36 ℃的情況下，胚胎無(wú)法成活，溫度在26～30 ℃雌性個(gè)體居多，在30～34 ℃時(shí)，雌雄個(gè)體都有，而在34～36 ℃時(shí)雄性個(gè)體占比較大。這些研究結(jié)果的差別可能與孵化介質(zhì)、濕度以及所處環(huán)境有很大關(guān)系。雖然試驗(yàn)結(jié)果不同，但均表明孵化溫度確實(shí)可以影響中華鱉的性別。綜合大量試驗(yàn)表明：在一定溫度(26～36 ℃)范圍內(nèi)，隨著溫度升高，中華鱉雄性率提高，最適孵化溫度在32 ℃左右，雄性率最高可達(dá)90%以上。

1.2外源激素動(dòng)物性別的決定和性別的分化與很多因素有關(guān)，除了基因和溫度對(duì)性別分化有重要影響外，眾多類(lèi)固醇激素也起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。在眾多外源激素中，雌二醇、甲基睪丸酮、芳香化酶抑制劑對(duì)于中華鱉性別分化的影響最大。

1.2.1雌二醇。雌二醇(Estradiol，E2)是雌激素中的一種天然激素，作用于性腺分化不明顯時(shí)期，能夠有效調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物卵巢的生長(zhǎng)和發(fā)育，刺激并誘導(dǎo)性腺向雌性方向轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)性腺快速成熟[11]。

方永強(qiáng)等[12]在鯔魚(yú)性別未分化期，喂食添加E2的飼料，鯔魚(yú)可全雌發(fā)育，且比未經(jīng)處理的鯔魚(yú)發(fā)育快，進(jìn)入性成熟。在卵巢分化時(shí)期，E2處理可降低睪酮的水平，從而改變雌雄激素比例，誘導(dǎo)雌性化的發(fā)生。E2在性腺未分化時(shí)期促進(jìn)其發(fā)育，在性腺發(fā)育成熟后，亦可改變其性別。溫茹淑等[13]用E2作用于性腺發(fā)育成熟的劍尾魚(yú)，發(fā)現(xiàn)精巢內(nèi)的精小囊數(shù)量減少，精原細(xì)胞發(fā)育停滯，精子數(shù)量稀少甚至沒(méi)有。孫鵬[14]用E2處理雄性中華絨螯蟹后，雄性性腺的繼續(xù)發(fā)育受到抑制，性腺退化，并且逐漸朝雌性發(fā)育，造成這種現(xiàn)象期主要是由于雄性特異基因表達(dá)的降低和雌性特異基因表達(dá)的增高。

唐瑤[15]在中華鱉卵性別分化期注射E2，發(fā)現(xiàn)E2等能夠明顯減少中華鱉的孵化時(shí)間，且孵化的中華鱉全部為雌性。將添加E2的飼料投喂給剛孵化的雄性稚幼鱉，性別并未像前面報(bào)道的劍尾魚(yú)一樣發(fā)生性別轉(zhuǎn)化，說(shuō)明雌二醇不能使已孵化出卵的中華鱉性別特征發(fā)生改變。王莉等[16]在中華鱉性腺分化早期使用E2對(duì)胚胎進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)E2能顯著降低雄性性別關(guān)鍵因子DMRT1、SOX9 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，從而抑制雄性分化，促進(jìn)卵巢細(xì)胞發(fā)育?？梢?jiàn)一定濃度的雌二醇對(duì)于中華鱉分化為雌性個(gè)體具有很好的誘導(dǎo)作用，但是超過(guò)一定濃度以后，隨著濃度的增加雌性率下降。

1.2.2甲基睪丸酮。甲基睪丸酮(MT)又名甲基睪丸素，是一種人工合成的雄性激素，一般為白色或乳白色結(jié)晶性粉末，能夠促進(jìn)雄性動(dòng)物精巢的發(fā)育和成熟，在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用較多。在魚(yú)類(lèi)性腺誘導(dǎo)方面作用明顯，且不同濃度對(duì)各種魚(yú)類(lèi)有不同的生物學(xué)作用，國(guó)內(nèi)外有大量研究報(bào)道。國(guó)內(nèi)張虹[17]將拌有100 μg/g的17-α-甲基睪丸酮的飼料投喂于雌核發(fā)育的草魚(yú)，發(fā)現(xiàn)73.3%個(gè)體性腺有向精巢發(fā)育的趨勢(shì)，且有23.3%的個(gè)體性腺發(fā)育遲緩，出現(xiàn)畸形，而對(duì)照組性腺發(fā)育正常，雌雄比例均衡，表明17-α-甲基睪丸酮能有效誘導(dǎo)雌核發(fā)育草魚(yú)性腺向雄性轉(zhuǎn)化。

范俊杰等[18]研究不同濃度MT對(duì)雌性食蚊魚(yú)形態(tài)雄性化的影響，設(shè)置4個(gè)濃度梯度(0、5、50、500 nmol/L)，采用浸浴法處理生長(zhǎng)發(fā)育期間的雌性個(gè)體，結(jié)果表明MT雌激素效應(yīng)明顯，且濃度在50～500 nmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度增大，雌魚(yú)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)形態(tài)雄性化比例增大。

國(guó)外相關(guān)研究報(bào)道也比較多，Bhandari等[19]用MT處理尼羅羅非魚(yú)雌性個(gè)體，結(jié)果表明在性別分化期外源性雄激素通過(guò)抑制類(lèi)固醇關(guān)鍵酶，實(shí)現(xiàn)羅非魚(yú)雄性化。Chatain等[20]采用17α-甲基去氫睪丸酮投喂的方法獲得了全雄性舌齒鱸。Wassermann等[21]采用雄性激素浸泡處理成功誘導(dǎo)尼羅羅非魚(yú)的性反轉(zhuǎn)，雄性率最高可達(dá)100%。Piferrer等[22]研究表明，提高17α-甲基睪丸酮濃度卻導(dǎo)致銀大馬哈魚(yú)雌性比例增加。

MT對(duì)中華鱉性別分化方面的影響也有報(bào)道，胡增高[23]對(duì)3種龜鱉目血漿中性激素隨季節(jié)性的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)中華鱉雄性個(gè)體血漿中性激素含量最低，而在交配期血漿中睪酮含量最高，說(shuō)明睪酮能促進(jìn)精子的形成。唐瑤[15]分別以濃度為25、50、100 mg/kg的MT投喂孵化出卵的仔稚鱉，在喂養(yǎng)到30 d時(shí)，稚鱉雄性特征顯現(xiàn)。表明在性別決定前用甲基睪丸素處理可以提高仔稚鱉的雄性率。而葉玉珍等[24]以甲基睪丸素處理不同時(shí)期的中華鱉胚胎，所孵出的鱉在出生后的第1天就能觀(guān)察到明顯的雄性副性征，并且100%的個(gè)體外部形態(tài)發(fā)生很大改變，生殖器明顯外翻，背甲稍長(zhǎng)，尾巴粗長(zhǎng)并露出背板的裙邊。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)，指出適宜濃度的MT能夠促進(jìn)中華鱉雄性性腺的發(fā)育，對(duì)于提高雄性率意義重大。

1.2.3芳香化酶抑制劑。在類(lèi)固醇激素的代謝過(guò)程中，通常需要多種酶的參與和催化，其中一種酶稱(chēng)為芳香化酶(aromatase)，是體內(nèi)催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶，這一轉(zhuǎn)化過(guò)程對(duì)魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)和兩棲類(lèi)等脊椎動(dòng)物的性別分化和性腺發(fā)育是必不可少的。芳香化酶抑制劑(AI)通過(guò)抑制芳香化酶的活性，從而抑制雌激素的合成和分泌，使胚胎內(nèi)雌激素減少而雄性激素相對(duì)增加，使胚胎向雄性轉(zhuǎn)化。

AI在水產(chǎn)動(dòng)物研究中應(yīng)用較廣，在魚(yú)類(lèi)研究中相關(guān)報(bào)道也較多。國(guó)內(nèi)李廣麗等[25]采用腹部埋植方式將AI作用于2齡雌性赤點(diǎn)石斑魚(yú)性腺，試驗(yàn)過(guò)程中魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞逐漸退化，而精原細(xì)胞大量增殖，幼魚(yú)由雌性轉(zhuǎn)為雄性，成功實(shí)現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明AI在魚(yú)類(lèi)性別分化上誘導(dǎo)作用明顯。傅麗容等[26]研究AI對(duì)中華條頸龜性別的控制，指出在30 ℃條件下孵化受精卵，在孵化20 d時(shí)涂抹一定濃度的AI，暫養(yǎng)7 d后進(jìn)行性別鑒定，試驗(yàn)組雄性率最高可達(dá)95%，而對(duì)照組雄性率最高為63%，說(shuō)明AI能夠有效提高中華條頸龜?shù)男坌月省?/p>

賈一何[27]為了研究芳香化酶對(duì)烏蘇里擬鲿仔魚(yú)生理結(jié)構(gòu)的影響，將不同濃度的AI飼料投喂開(kāi)口2d的小仔魚(yú)，連續(xù)投喂90 d，飼養(yǎng)到195日齡時(shí)觀(guān)察其生長(zhǎng)和性腺發(fā)育情況。結(jié)果表明：AI對(duì)于烏蘇里擬鲿生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用，但是能夠抑制芳香化酶合成雌激素，導(dǎo)致雌性仔魚(yú)卵巢內(nèi)細(xì)胞排列不規(guī)則，卵細(xì)胞不能正常發(fā)育。張厚梅等[28]為了研究芳香化酶與黃鱔(monopterus albus)性逆轉(zhuǎn)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以不同性別黃鱔的性腺和腦組織為試驗(yàn)材料，采用免疫組化方法檢測(cè)芳香化酶在不同性別黃鱔的性腺和腦組織上的定位及其變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示：雌性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)上，雄性黃鱔性腺中，主要分布在各級(jí)精母細(xì)胞上。分布在腦組織中的AI在黃鱔由雌性轉(zhuǎn)化為雄性過(guò)程中含量逐漸減少，意味著黃鱔性腺和腦組織中的芳香化酶可能參與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)過(guò)程。

國(guó)外關(guān)于AI在魚(yú)類(lèi)性別分化方面也有報(bào)道，Piferrer等[29]以濃度為10 mg/dm3AI浸泡性別未分化的大鱗大麻哈魚(yú)，處理2 h后發(fā)現(xiàn)原來(lái)具有雌性遺傳基因的個(gè)體發(fā)育為雄性，且雄性性腺的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與正常雄魚(yú)無(wú)差異。

關(guān)于AI在中華鱉研究方面，王莉等[16]采用AI在中華鱉胚胎孵化的第15期和第17期，滴加50 μg/μL的AI 5 μL，待孵化出殼后對(duì)其性腺進(jìn)行染色分析，發(fā)現(xiàn)其性腺結(jié)構(gòu)明顯雄性化且雌性比例顯著下調(diào)至13.1%。包海聲等[30]將中華鱉受精卵在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵化至15 d時(shí)，在正對(duì)胚胎的卵殼位置上滴加20 μg/μL的AI，第2天重新滴加相同劑量的藥物，置于相同環(huán)境下繼續(xù)孵化，孵化至25期時(shí)收集胚胎性腺。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)AI處理的中華鱉性腺內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)雌性向雄性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，對(duì)照組中雄性稚鱉占51.0%，而AI處理組中，雄性比例顯著增加到91.9%。

綜合大量試驗(yàn)結(jié)果表明：一定濃度AI通過(guò)抑制芳香化酶的分泌，從而抑制雌性激素的合成，在生產(chǎn)實(shí)踐中有效抑制中華鱉體內(nèi)該激素的分泌對(duì)于提高雄性率意義重大。

2 中華鱉高雄性率調(diào)控技術(shù)應(yīng)用

依據(jù)中華鱉高雄性率相關(guān)研究及可行性、方便操控、使用成本低的原則，不同的企業(yè)可選擇相應(yīng)的調(diào)控技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。目前，控溫控濕孵化房、控溫控濕孵化箱、外源激素人工誘導(dǎo)法等幾種措施均在生產(chǎn)中得到應(yīng)用，而控溫控濕孵化房在當(dāng)前實(shí)現(xiàn)中華鱉高雄性率產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中最普遍。

祝茜等[31]通過(guò)孵化試驗(yàn)表明，人工孵化比自然孵化損耗小，可以提高孵化率，大大縮短孵化時(shí)間，而調(diào)溫調(diào)濕箱是最穩(wěn)定和方便的孵化方式，能達(dá)到高孵化率的效果。在缺乏此設(shè)備時(shí)，因陋就簡(jiǎn)，用自制孵化盤(pán)孵化，細(xì)心管理，保持適宜的溫度和濕度，也能達(dá)到較高的孵化率。林輝[32]認(rèn)為鱉卵人工孵化的關(guān)鍵是控制孵化室的溫度和濕度，室內(nèi)溫度控制在32～33 ℃，此時(shí)孵化箱內(nèi)沙溫為30～31 ℃，室內(nèi)相對(duì)濕度為80%～85%。邢春英[33]對(duì)中華鱉采取控溫孵化，控制恒溫在30 ℃，41～42 d便會(huì)全部出殼，出殼率可達(dá)95%以上，而且稚鱉對(duì)卵黃吸收完全，體質(zhì)健壯，養(yǎng)殖成活率相對(duì)較高。因此，在中華鱉產(chǎn)業(yè)化良種生產(chǎn)中，使用控溫控濕孵化房和孵化箱，能較好地實(shí)現(xiàn)中華鱉高雄性率。

3 結(jié)語(yǔ)

動(dòng)物的性別研究一直都是發(fā)育生物學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)探討的熱點(diǎn)話(huà)題，由于很多動(dòng)物性別的可塑性，很多專(zhuān)家學(xué)者希望通過(guò)控制其性別來(lái)提高在某方面的利用價(jià)值。由于中華鱉個(gè)體雄性較雌性具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，養(yǎng)殖戶(hù)更加熱衷于雄性的孵化和養(yǎng)殖。在這個(gè)研究過(guò)程中，如果能找到一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉且高子代雄性率的誘導(dǎo)技術(shù)，將會(huì)大大提升中華鱉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為此，闡述影響中華鱉雄性率的主要因子，從國(guó)內(nèi)外大量研究資料中總結(jié)得出一些結(jié)論。當(dāng)然，在中華鱉性別分化方面還存有未知領(lǐng)域，有待今后進(jìn)一步探索。