逯曉波

（中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室，遼寧 沈陽 110122）

惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)嚴重危害人類健康的疾病之一，在我國其發(fā)生率呈逐年上升趨勢。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是遺傳和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果，找尋有效的遺傳生物學標志，做到早期預防和合理治療，對于提高惡性腫瘤的生存率和生存質(zhì)量具有重要意義。

環(huán)境致癌因子如多環(huán)芳烴經(jīng)體內(nèi)代謝后成為直接致癌物，攻擊DNA等生物大分子，生成DNA加合物等造成DNA的原始損傷，成為癌變的起始動力。目前認為大多數(shù)環(huán)境致癌因子可損傷DNA并由此導致基因突變和細胞癌變是遺傳毒理學研究的核心機制之一。但是正常細胞中也存在著維護自身基因組穩(wěn)定性的修復系統(tǒng)用來修復環(huán)境致癌因子造成的DNA損傷。人體常見的DNA修復系統(tǒng)至少包括堿基切除修復（base excision repair，BER）、核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）、錯配修復（mismatch repair，MMR）和雙鏈斷裂修復（double strand break repair，DSBR）系統(tǒng)等。它們共同構成對DNA損傷的防衛(wèi)機制，在細胞DNA受到外界有害刺激損傷后，修復DNA的受損部位，以維持基因組的穩(wěn)定性。DNA修復效率存在個體差異，不同個體或細胞具有不同DNA修復效率，與惡性腫瘤發(fā)生風險及預后治療密切相關。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）被稱作第三代遺傳學標記，其在人類基因組中并不是隨機分布的，如果連鎖不平衡程度較高，則可能出現(xiàn)SNP在單個區(qū)域中的結(jié)構模式，即單體型（haplotype）。首類環(huán)境應答基因—DNA損傷修復基因的SNP及單體型作為目前復雜疾病重要的生物學標志，一直是腫瘤易感及預后治療研究的熱點［1］。但近年來隨著分子生物標志研究的深入，發(fā)現(xiàn)基于堿基序列改變的SNP及單體型顯然不足以全面反映轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組多態(tài)性，而表觀遺傳學RNA調(diào)控領域的研究進展卻拓寬了相應的研究思路。DNA修復基因可變剪接（alternative splicing，AS）及非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡作為惡性腫瘤發(fā)生及預后生物學標志的研究及其意義備受關注。

1 可變剪接（A S）

AS是基因轉(zhuǎn)錄后一項精密而復雜的調(diào)控機制，屬于廣義的表觀遺傳學范疇，是當前遺傳學研究的熱點之一［2］。真核生物中，絕大多數(shù)基因的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-mRNA必須經(jīng)過剪接等加工過程，才能形成成熟的mRNA。AS是指同一種premRNA具有多種剪接程序，形成不同的mRNA。在人體中，幾乎所有的多外顯子初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都經(jīng)過AS，平均來說，一個人類基因由8～10個外顯子組成，選擇性剪接的多樣化能力可以使一個單基因產(chǎn)生兩個到幾千個的剪接異構體。AS的類型主要有7種，分別為內(nèi)含子保留、可變3′剪接位點、可變5′剪接位點、外顯子跳過、互斥可變外顯子、可變初始外顯子和可變終末外顯子等［3］。

AS是蛋白質(zhì)組多樣性和基因表達復雜性的重要機制，也被認為是癌癥表達的天然來源［4］，AS的異常改變使得基因在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生剪接異構體，編碼出異常蛋白質(zhì)。剪接異構體和癌癥相關的細胞遷移、細胞生長調(diào)控、激素響應性、細胞死亡和化療反應中基因表達變化有關，成為腫瘤的生物標志和分子靶點。有證據(jù)表明影響癌基因、抑癌基因和其它癌癥相關基因的剪接突變在癌癥的起始和發(fā)生發(fā)展過程中均會出現(xiàn)，并且存在因果聯(lián)系。但目前導致腫瘤發(fā)生過程中剪接缺陷的機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)順式作用元件中的遺傳和體細胞突變，反式調(diào)節(jié)因子的成分、濃度、定位以及活性的變異，都會影響剪接位點的識別和作用，從而導致癌變［5］。

2 D NA修復基因可變剪接與腫瘤

在腫瘤患者體內(nèi)有許多錯配修復基因損傷造成的突變，導致異常mRNA剪接。DNA錯配修復基因 MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2突變是造成Lynch綜合征（又稱遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌，HNPCC）和包括Muir-Torre綜合征和結(jié)構性錯配修復缺陷綜合征等其他相關遺傳性惡性腫瘤的原因。MLH1基因可變剪接最常見的模式是外顯子跳過。外顯子4、6、9、10、11、15、16和17是最容易跳過的外顯子［6］，隨著關于MLH1可變剪接的報道越來越多，有研究表明MLH1可變剪接產(chǎn)物代表了這些跳過外顯子的不同組合。與MLH1基因相反，MSH2和MSH6可變剪接的機制則是利用隱藏的剪接位點［7］。

NER是DNA損傷修復系統(tǒng)中最重要而靈活的一種，對多種DNA雙螺旋損傷變性，如多環(huán)芳烴、紫外線C等環(huán)境致癌因子介導的DNA加合物，NER發(fā)揮主要的切除修復作用。切除修復交叉互補基因1（ERCC1）位于19q13，在啟動NER的損傷修復中至關重要，其編碼的核蛋白具有結(jié)構特異性核酸內(nèi)切酶活性，在雙鏈DNA交界邊緣酶促5′裂解，以切除損傷的寡核苷酸，是NER的限速酶。針對ERCC1可變剪接研究主要集中在卵巢癌細胞對順鉑的敏感性方面，Bosma等［8］應用cDNA文庫構建包含人類ERCC1基因的順鉑耐藥細胞株，其中9種發(fā)現(xiàn)了ERCC1剪接異構體（5′-truncated ERCC1）的存在：即缺少位于第1外顯子42 bp的ERCC1剪接異構體。而該42 bp序列可與轉(zhuǎn)錄因子抑制劑結(jié)合，會減低NER系統(tǒng)功能，但Winter等［9］隨后卻否定了上述結(jié)論，認為該ERCC1剪接異構體可在各種癌組織中廣泛表達，與腫瘤發(fā)生及預后并無關聯(lián)。Sun等［10］檢測到ERCC1第8外顯子缺失的剪接異構體，提出該異構體雖然沒有改變ERCC1蛋白表達水平，但能降低NER系統(tǒng)的切除修復能力，增加細胞對順鉑的敏感性。

著色性干皮病互補因子C（XPC）基因編碼的XPC蛋白在NER的早期階段，尤其是在識別損傷、開放復雜結(jié)構、修復蛋白質(zhì)復合物結(jié)構起著重要作用。XPC基因跨越33 kb和16個外顯子和15個內(nèi)含子。應用實時定量PCR測量XPC mRNA全長及其剪接異構體，發(fā)現(xiàn)在5號外顯子上有內(nèi)含子丟失；另外還有跳過外顯子4、7或12的剪接異構體。0.07%XPC基因跳過外顯子7，包含大量信息的外顯子7具有剪接受體和供體位點位。相比之下，0.7%XPC基因跳過外顯子4，包含少量信息的外顯子4也具有剪接受體。一個常見XPC基因內(nèi)含子11剪接受體位點SNP（C/A）降低信息含量。這種異常剪接的XPC mRNA亞型減少了DNA修復功能，更有助于腫瘤的發(fā)生［11］。

3 非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡

近年來，隨著二代測序和轉(zhuǎn)錄組測序技術的完善，大量新的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）如微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、環(huán)狀RNA（circle RNA，circRNA）和piRNA（Piwi蛋白相作用的RNA）等相繼被報道，不同ncRNA之間也存在相互調(diào)節(jié)的關系，從而形成一個相對完整的調(diào)控網(wǎng)絡。

miRNA是一類長度約有18～25個核苷酸的單鏈小分子RNA，對生命活動具有廣泛的調(diào)控作用。在動植物體內(nèi)可以和靶基因mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，導致mRNA裂解或抑制翻譯來調(diào)控相應基因表達。miRNA異常表達可能導致許多人類常見復雜疾病的發(fā)生。迄今為止，miRNA與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、預后均密切相關。miRNA及其綁定位點的SNP可以影響miRNA介導的調(diào)控。近年來隨著對于mRNA的3′UTR及miRNA功能研究的不斷深入，對于SNP研究的重點已由編碼區(qū)轉(zhuǎn)向非編碼區(qū)。Smits等［12］在2011年的研究中發(fā)現(xiàn)，KRAS基因mRNA 3′UTR的SNPs rs61764370在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的早期診斷和治療策略選擇上具有重要意義，發(fā)現(xiàn)rs61764370 T等位基因會增加CRC的發(fā)生風險。Ahangari等［13］研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控炎癥反應的NOD2基因3′UTR區(qū)的SNP與CRC發(fā)生風險有關，炎癥反應會造成DNA損傷、細胞增殖紊亂和異常血管的生成，與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關。

lncRNA是一類核苷酸序列長度大于200 nt的線性RNA，不具備編碼蛋白的能力，大量存在于人類基因組中，并且具有組織和細胞特異性，但在不同物種中保守性較差［14］。正是由于lncRNA長度較長，保守性較差，因此lncRNA的結(jié)構和功能都較為復雜，但主要是以調(diào)控基因表達為主［15］。近年來研究表明lncRNA在正常生命活動和以腫瘤為代表的疾病發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用［16］。在腫瘤研究中，人們發(fā)現(xiàn)了許多l(xiāng)ncRNA參與到腫瘤的表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、激素調(diào)控和DNA損傷修復［17］等。并且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些lncRNA既可以與mRNA競爭性結(jié)合miRNA，也可以結(jié)合到mRNA 3′UTR區(qū)，阻止miRNA與mRNA結(jié)合［18］。

circRNA是一類最新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀單鏈非編碼RNA，在真核生物和人的所有組織中均有表達，且穩(wěn)定性較好。相對于miRNA和lncRNA而言，circRNA研究的時間較晚，對其來源了解很有限。目前，人們發(fā)現(xiàn)circRNA的主要作用是充當miRNA海綿或RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）海綿，進而調(diào)控基因表達［19-20］。circRNA的產(chǎn)生方式與一般線型RNA不同，主要包括外顯子的環(huán)化和內(nèi)含子的環(huán)化。circRNA在轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達調(diào)控有著重要的作用，可增強基因的轉(zhuǎn)錄。此外，circRNA可調(diào)節(jié)pre-mRNA的剪接，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀外顯子環(huán)化過程可競爭性抑制pre-mRNA經(jīng)典剪接過程，從而影響蛋白質(zhì)的生成［21］。

miRNA可調(diào)節(jié)lncRNA的表達，進而影響lncRNA的調(diào)控作用。Yoon等［22］研究發(fā)現(xiàn)miRNA let-7家族可結(jié)合Ago2蛋白，從而影響lncRNA-p21的活性。lncRNA也可調(diào)控miRNA的表達，如lncRNA序列中存在與miRNA靶目標mRNA相似片段，可結(jié)合miRNA，降低miRNA對目標mRNA的調(diào)節(jié)作用。lncRNA可與mRNA互補配對，導致miRNA-RISC不可與mRNA結(jié)合，從而影響其所介導的RNA降解過程［23］。lncRNA也可剪切形成miRNA：lncRNA-MD1能產(chǎn)生miR-206以及miR-133b。LncRNA H19也可剪切生成miR-675［24］。

近期研究表明，circRNA可與某些miRNA結(jié)合成為其miRNA的分子海綿，從而抑制miRNA的相關活動。Xie等［25］通過對細胞增殖以及CRC的侵襲過程的研究發(fā)現(xiàn)，在CRC組織中，HSA circ_001569可作為miR-145的分子海綿上調(diào)miR-145的目標功能基因表達。小腦變性相關蛋白1（CDR1）基因可以翻譯生成一種環(huán)形反義轉(zhuǎn)錄物，稱為小腦變性相關蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物（CDR1as）。CDR1as可以與miRNA相互作用，也可被miR-671切割。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as中包含miR-7的70余種結(jié)合位點。Li等［26］研究發(fā)現(xiàn)cir-ITCH跨越E3泛素蛋白連接酶（ITCH）的某些外顯子，對miR-7、miR-17和miR-214也具有海綿作用。

4 非編碼RNA對D NA損傷修復的調(diào)控

miRNA可以調(diào)控DNA損傷的識別、信號轉(zhuǎn)導及損傷修復過程等。共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）是直接感受DNA雙鏈斷裂損傷并起始諸多DNA損傷信號反應通路的主開關分子，現(xiàn)也被證實ATM基因可能成為許多miRNA調(diào)控的靶點，如可受到miR-223、miR-181a、miR-26a、miR-27a、miR-214、miR-18a等的調(diào)控，這些miRNA通過對ATM介導的信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)增加了細胞對紫外線的敏感性［27］。γH2AX是DNA損傷修復的識別元件，可發(fā)現(xiàn)和識別受損的DNA。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，miR-24以及miR-138可直接作用于γH2AX從而調(diào)控DNA損傷修復過程。γH2AX是miR-138的目標基因，miR-138的過度表達會影響組蛋白H2AX的表達，使其表達下調(diào)，從而增加受損后染色體的不穩(wěn)定性，有利于DNA損傷修復。miRNA也可以控制DNA雙鏈斷裂修復的非末端連接修復（NHEJ）和同源重組修復（HR）通路。近期研究表明，miR-124可直接結(jié)合Ku70、NHEJ通路的關鍵修復蛋白，從而調(diào)控DNA雙鏈斷裂修復［28］。miR-9也可結(jié)合HR通路的關鍵修復蛋白BRCA1，阻礙順鉑介導的DNA損傷修復，從而調(diào)控卵巢癌的發(fā)生［29］。De Summa等［30］通過對家族性和散發(fā)乳腺癌病例研究發(fā)現(xiàn)miR-17不僅僅對BRCA1基因表達存在有調(diào)控作用，其也可作為APE1/REF1的調(diào)節(jié)因子，進而影響堿基錯配修復的進程。miR-17可與BRCA1的3′UTR區(qū)相結(jié)合進而實現(xiàn)相關調(diào)節(jié)作用。

Wang等［31］通過對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究發(fā)現(xiàn)miR-106a可上調(diào)ERCC1基因的表達，從而影響核苷酸切除修復過程。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中ERCC1基因的表達程度普遍增加，研究表明ERCC1在U87/DDP和U251/G細胞系中的表達明顯高于對照細胞系U87和U251。研究發(fā)現(xiàn)在U87/DDP和U251/G細胞系中通過miR-106a可抑制ERCC1表達程度，使其低于對照組的水平，從而證實miR-106a可改變細胞的DNA修復能力。Valeri等［32］將miR-21順時轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細胞后，實驗結(jié)果得知hMSH2、hMSH6蛋白的表達量在轉(zhuǎn)染后明顯下降，證明miR-21可以結(jié)合在hMSH2、hMSH6基因mRNA的3′UTR區(qū)，通過下調(diào)MMR系統(tǒng)的關鍵基因hMSH2、hMSH6的表達，影響MMR系統(tǒng)功能，從而導致結(jié)腸癌的發(fā)生。Zhong等［33］研究發(fā)現(xiàn)miR-31-5p可以結(jié)合在MLH1的mRNA的3′UTR區(qū)，抑制miR-31-5p表達后可增加MLH1蛋白的水平，從而調(diào)控細胞周期。該試驗證明了miR-31-5p通過調(diào)控MMR的相關蛋白表達對結(jié)腸癌的發(fā)展產(chǎn)生影響。

lncRNA可作為DNA損傷后的信號傳導分子，刺激細胞對DNA損傷的應答［34］。LncRNA p21就是其中之一，其可結(jié)合hnRNP-K共同激活p53依賴的p21基因表達。lncRNA也可誘導細胞在DNA受損后進行修復的過程。lncRNA PANDA已證實具有誘導活性，可調(diào)控DNA損傷后的細胞應答［35］。DNA損傷后，PANDA在p53依賴通路中被激活，可與轉(zhuǎn)錄元件NF-YA相結(jié)合而調(diào)控基因表達。lncRNA也可作為指導分子參與DNA損傷修復過程。CCND lncRNAs可復原和調(diào)控TLS的活性，從而間接調(diào)控DNA損傷修復過程［36］。

此外，在尋找DNA修復基因ERCC1區(qū)域上下游10 kb的相關lncRNA以及ERCC1產(chǎn)生的circRNA的一些嘗試可供借鑒。在lncRNA相關數(shù)據(jù) 庫（LNCipedia，lncRNAdb，NONCODE v4.0 和Biogazelle）中，預測到若干可能的lncRNAs，根據(jù)它們的長度、編碼蛋白的能力進行了篩選，得到了兩個lncRNA，分別為NONHSAT066776和NONHSA T066779。其中NONHSAT066776位于ERCC1最后一個外顯子與內(nèi)含子交界處，而NONHSAT066779位于ERCC1第二個外顯子，并跨該外顯子。推測NONHSAT066779則可能通過直接調(diào)控ERCC1而影響DNA修復。在circRNA相關數(shù)據(jù)庫（find_circ、MapSplice、CIRCexplorer、circRNAFinder 和deepBase）中，預測出ERCC1多個相關的circRNAs。根據(jù)其在不同細胞系中表達的差異，最終得到了兩個circRNA，其中hsa-circRNA12243-9由ERCC1轉(zhuǎn)錄本 NM_001983.3的第 7、8、9 外顯子環(huán)化而成；hsa-circRNA12243-14由ERCC1轉(zhuǎn)錄本NM_001983.3的第8和第9外顯子環(huán)化而成。我們推測兩個circRNA可能會影響miRNA對ERCC1的調(diào)控或者直接調(diào)控ERCC1進而影響DNA修復。

綜上所述，通過對環(huán)境應答基因：DNA修復基因的AS及非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡的深入研究，尋找有效的腫瘤發(fā)生及預后生物學標志，將為實現(xiàn)腫瘤個體化預防及治療提供重要的理論依據(jù)。

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