張曉茹，匡文華，成 鷹，杜 麗，張冬琳，郝永昌，雷 明，劉 濤，焦寒偉，王鳳陽(yáng)＊，祁 超

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），?？谑袆?dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228；2.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430079）

Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）家族是一組重要的、介導(dǎo)天然免疫的模式識(shí)別受體［1］。TLRs的發(fā)現(xiàn)源于對(duì)果蠅Toll蛋白的研究，1997年，Medzhitov R等［2］首次在人發(fā)現(xiàn)與果蠅同源的Toll蛋白，并命名為TLR。由于TLR能識(shí)別病原體，在病原入侵機(jī)體時(shí)啟動(dòng)天然免疫，提示其在抗感染中發(fā)揮重要作用。

在哺乳動(dòng)物及人類已發(fā)現(xiàn)11種TLRs（TLR1～TLR11），目前的研究主要集中在TLR4和TLR2。根據(jù)TLRs在不同組織和細(xì)胞的分布特點(diǎn)，可將其分為3種類型。TLR2屬于限制存在型，主要分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞［3］。TLR2識(shí)別的配體最多，可介導(dǎo)多種不同的病原微生物及其產(chǎn)物引起的、性質(zhì)相似的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)及細(xì)胞因子產(chǎn)生。因此，TLR2被認(rèn)為是具中心作用的或中樞型識(shí)別（central pattern recognition）受體。TLR2也可介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)病毒的識(shí)別［4］。

除介導(dǎo)外源性激活劑的識(shí)別外，TLR2還介導(dǎo)對(duì)內(nèi)源性激活劑的識(shí)別。在識(shí)別方式上，已發(fā)現(xiàn)TLR2可與TLR1、TLR6組合識(shí)別脂肽和其它的TLR2激活劑［5］。TLR2還可協(xié)助TLR4參與人體內(nèi)對(duì)脂多糖（LPS）的反應(yīng)［6］。TLR2在廣譜識(shí)別的基礎(chǔ)上，介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)：①促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放、引發(fā)炎癥反應(yīng)；②誘導(dǎo)殺菌活性；③促凋亡與抗凋亡作用；④促進(jìn)免疫細(xì)胞DC成熟；⑤參與T細(xì)胞記憶形成；⑥參與吞噬作用；⑦參與佐劑效應(yīng)。

由于TLR2在機(jī)體免疫應(yīng)答中有重要的作用，TLR2與疾病的關(guān)系受到特別的重視。已經(jīng)確定人的TLR2基因與一些炎性傳染疾病有關(guān)。水牛TLR2基因的研究較少，本研究采用RT－PCR技術(shù)，從水牛外周血白細(xì)胞中克隆TLR2全基因，并通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)與功能，為進(jìn)一步研究其生物活性及信號(hào)傳導(dǎo)途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液 興隆水牛新鮮血液采自海南定安。

1.1.2 主要試劑 血液總RNA提取試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品；RNAiso Reagent、TaKaRa LATaq酶、高保真DNA聚合酶Pyrobest、pMD20－T Vector試劑盒以及DNA膠回收試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit為Fermentas公司產(chǎn)品；EZNA Plasmid Mini KitⅠ試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α由海口市動(dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照NCBI／GenBank上登載的水牛TLR2DNA序列（EU178742），設(shè)計(jì)并合成以下兩對(duì)引物。

F1：5′－ATGTCAAACACAGTCATTCAC－3′，R1：5′－CCACCGACAAGTTTCAGG－3′，用 于 5′端基 因 的 擴(kuò) 增； F2：5′－CCTGGCCCTTCCTTCAAACC－3′，R2：5′－AAGGACCACCACCAGACCAA－3′，用于3′端基因的擴(kuò)增；而F1、R2可進(jìn)行全基因的擴(kuò)增。引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.2 外周血白細(xì)胞總RNA提取 RNA提取采用Trizol法，取水牛新鮮血液，按照血液總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳及紫外分光光度法鑒定RNA純度及濃度后，置－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT－PCR 克隆 MyD88基因 取1μL 總RNA為模板，用RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈，方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA質(zhì)量，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別利用引物F1、R1和F2、R2，以1μL cDNA為模板進(jìn)行降落PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2×GC buffer 25μL，dNTP Mixture（2.5mmol／L each）4 μL，上下游引物各1μL，模板1μL，LATaq DNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，滅菌去離子水17.5μL，總體積5 0μL。反應(yīng)條件為：94℃變性3min；94℃30s，62℃30s，72℃1.5min，從此循環(huán)開(kāi)始進(jìn)行降落PCR，退火溫度每個(gè)循環(huán)降低1℃，其他條件不變，直到退火溫度分別降到51℃及49℃；再按94℃30s，51℃和49℃30s，72℃1.5min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72℃5min。反應(yīng)結(jié)束后，用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。然后將全部反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。

1.2.4 TA克隆及測(cè)序 將回收的兩段PCR產(chǎn)物分別與pMD20－T Vector進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸埃希菌，涂布平板，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落進(jìn)行菌落PCR，后提取質(zhì)粒酶切鑒定，篩選出的陽(yáng)性重組菌送公司測(cè)序。

1.2.5 TLR2全長(zhǎng)序列拼接 根據(jù)所得兩部分序列的重疊區(qū)進(jìn)行重疊PCR，完成全長(zhǎng)序列拼接。首先用高保真酶Pyrobest以測(cè)序正確的兩種質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增出兩部分序列，膠回收純化目的條帶，命名F1－R1、F2－R2；再在250μL的滅菌EP管中加入下列溶液：10×Pyrobest buffer 5μL，dNTP Mixture（2.5mmol／L each）4μL，Pyrobest DNA 聚合酶（5U／μL）0.5μL，F(xiàn)1－R1、F2－R2回收片段各1 μL，滅菌去離子水38.5μL；按94℃3min，94℃30 s，68℃1.5min，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)后，再加F1、R2引物各1μL，按94℃30s，54℃30s，72℃2.5min，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，最后加LATaq DNA聚合酶0.5μL，72℃保溫10min，膠回收純化目的帶。將得到的全長(zhǎng)TLR2片段與pMD20－T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定后送公司測(cè)序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 采用DNAMAN軟件對(duì)克隆得到的TLR2核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析和推導(dǎo)，并 利 用 SignalP、ExPASy、TMHMM 和SMART等網(wǎng)站在線程序?qū)LR2蛋白信號(hào)肽、疏水性輪廓、跨膜信息、關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR及全長(zhǎng)拼接結(jié)果

以水牛外周血白細(xì)胞總RNA為模板，通過(guò)RTPCR，用引物F1、R1和F2、R2分別擴(kuò)增出2條特異性條帶。經(jīng)回收、克隆測(cè)序后，表明擴(kuò)增的片段大小分別為1 244bp和1 360bp，與預(yù)期結(jié)果一致。根據(jù)所得兩個(gè)片段序列重疊區(qū)進(jìn)行重疊PCR，拼接得到總長(zhǎng)為2 455bp（包括5′和3′端非翻譯區(qū)序列）的TLR2全長(zhǎng)序列，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

圖1 TLR2克隆片段及全長(zhǎng)電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of cloned fragments and full length of TLR2

2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

將拼接的TLR2全長(zhǎng)序列進(jìn)行膠回收純化，克隆進(jìn)pMD20－T載體，挑取陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，得到約2 500 bp左右的目的片段（圖2），表明本試驗(yàn)克隆的目的基因TLR2成功插入到載體中。

圖2 重組質(zhì)粒pMD20－TLR2雙酶切鑒定電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic result of plasmid pET28a－MyD88 digested with EcoRⅠand XbaⅠ

2.3 TLR2基因測(cè)序結(jié)果及序列分析

核苷酸序列測(cè)序及分析結(jié)果表明，水牛TLR2 cDNA包含一個(gè)2 355bp的開(kāi)放閱讀框，A＋T含量為55.54%，C＋G含量為44.46%，共編碼784個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為90.2ku，等電點(diǎn)（pI）為6.92。用DNAMAN軟件將TLR2測(cè)序結(jié)果與Gen－Bank中登錄的水牛TLR2（EU178742）的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者核苷酸序列同源性達(dá)99.53%。ExPASy－ProtParam軟件在線分析結(jié)果表明，TLR2酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為88，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg＋Lys＋His）為110。

2.4 TLR2基因同源性分析

用DNAMAN軟件將測(cè)序所得TLR2ORF序列與GenBank中登陸的黃牛、人、黑猩猩、小鼠等動(dòng)物的ORF序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)海南水牛與黃牛（NM－174197）、馬 （NM－001081796）、人 （NM－003264）、黑 猩 猩 （NM－001130469）和 狗 （NM－001005264）的同源性較高，分別為97.88%、84.94%、83.12%、82.95% 和 82.74%；與 小 鼠（NM－011905）的同源性次之，為72.52%；與原雞（NM－204278）的最低，僅為58.81%。據(jù) TLR2核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，各種動(dòng)物TLR2基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上與物種間的親緣關(guān)系密切（圖3）。

2.5 TLR2蛋白分子的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5.1 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 信號(hào)肽是指分泌蛋白新生肽鏈N端的一段20～30氨基酸殘基組成的肽段，其作用是在蛋白質(zhì)分泌時(shí)引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。采用SignalP 3.0Server－prediction軟件分析表明，1～20個(gè)氨基酸為TLR2蛋白信號(hào)肽序列（圖4）。

2.5.2 疏水性分析 利用網(wǎng)上在線工具ExPASy－ProtScale程序預(yù)測(cè)了該蛋白的疏水性（圖5）。TLR2蛋白的疏水性最大值為3.322，最小值為－3.022，在氨基酸序列的5～19、206～226、345～358、586～612和724～741這5個(gè)區(qū)域都出現(xiàn)了較高的疏水性，表明這幾個(gè)區(qū)域富含疏水性氨基酸。

2.5.3 跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 利用網(wǎng)上在線工具TMHMM程序預(yù)測(cè)了TLR2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)（圖6），結(jié)果表明，該蛋白是一個(gè)由胞外區(qū)（1aa～587aa）、跨膜區(qū)（588aa～610aa）和胞內(nèi)區(qū)（611aa～784aa）三部分構(gòu)成的跨膜蛋白。通過(guò)與人、小鼠TLR2分子的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)推導(dǎo)的氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，水牛TLR2分子與人、鼠的胞內(nèi)區(qū)氨基酸序列相似性最高，分別為93.68%和87.36%，表明TLR2分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守；其次是跨膜區(qū)，分別為73.91%和69.57%，胞外區(qū)最低，分別為70.87%和59.11%，提示各個(gè)TLR分子的配體各有不同結(jié)構(gòu)。

圖3 水牛TLR2ORF序列與其他物種間的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of TLR2ORF sequences of buffalo with other species

2.5.4 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) SMART程序分析發(fā)現(xiàn)，水牛TLR2蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，胞外區(qū)主要包括：7個(gè)亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（leucine－rich repeats，LRR），其特征是亮氨酸間隔分布于幾個(gè)固定位點(diǎn)，這種結(jié)構(gòu)可加強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的黏連，有利于LRR參與對(duì)病原微生物或其產(chǎn)物的特異性識(shí)別，2個(gè)LRRTYP（leucine－rich repeats，typical subfamily）結(jié)構(gòu)域和1個(gè) LRRCT（leucine rich repeat C－terminal）結(jié)構(gòu)域；胞內(nèi)區(qū)主要包含一個(gè)TIR（Toll－interleukin 1－resistance）結(jié)構(gòu)域（圖7）。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，TIR結(jié)構(gòu)域可能介導(dǎo)同型蛋白之間的相互作用，從而提示水牛的TLR2蛋白可能通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域在病原體的識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。

圖4 水牛TLR2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Signal peptide prediction of buffalo TLR2protein

圖5 水牛TLR2蛋白疏水性分析結(jié)果Fig.5 Hydrophobicity of buffalo TLR2protein

圖6 水牛TLR2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Transmembrane helices prediction of buffalo TLR2protein

圖7 水牛TLR2蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果Fig.7 Domain prediction of buffalo TLR2protein

圖8 水牛TLR2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8 Secondary structure prediction of buffalo TLR2protein

2.5.5 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 使用NetPhos 2.0Server對(duì)蛋白序列的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：水牛TLR2蛋白結(jié)構(gòu)中磷酸化修飾位點(diǎn)共45個(gè)，其中絲氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)32個(gè)，蘇氨酸蛋白激酶位點(diǎn)8個(gè)，酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)5個(gè)，且磷酸化位點(diǎn)主要分布在胞外區(qū)（40個(gè)）和胞內(nèi)區(qū)（5個(gè)）。

2.5.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用HNN軟件預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖8），該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中 螺旋（Al－pha helix）占 46.43%，伸 展 結(jié) 構(gòu) 占 （Extended strand）13.90%，無(wú) 規(guī) 則 卷 曲 （Random coil）占39.67%。

3 討論

TLR2作為Toll樣受體家族中的重要成員，其在免疫應(yīng)答各個(gè)環(huán)節(jié)中的功能和作用日漸引起研究者的廣泛關(guān)注。TLR2可以識(shí)別多種病原體相關(guān)分子模 式 （pathogen associated molecular paterns，PAMPs），具有廣泛的配體識(shí)別譜。TLR2不僅可對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的胞壁成分肽聚糖（PGN）、脂磷壁酸（LTA）進(jìn)行模式識(shí)別，還可識(shí)別完整的革蘭陽(yáng)性菌，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。另外，TLR2在分支桿菌、螺旋體、支原體和酵母菌感染中也發(fā)揮重要作用，可通過(guò)識(shí)別脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）、脂蛋白／脂肽、細(xì)菌DNA等菌體成分來(lái)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)［7－9］。除對(duì)PAMPs的識(shí)別外，還有研究發(fā)現(xiàn)TLR2參與了對(duì)物理、化學(xué)及缺血等非感染因素所致細(xì)胞壞死的識(shí)別與炎癥反應(yīng)［6］。此發(fā)現(xiàn)為闡明天然免疫參與識(shí)別自身正常與非正常組織，及非感染性組織損傷修復(fù)的分子基礎(chǔ)提供了重要依據(jù)。在TLR2識(shí)別各種配體的過(guò)程中，TLR1和TLR6扮演著重要角色，它們與TLR2結(jié)合形成異物二聚體才能使TLR2誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，分泌各種細(xì)胞因子，發(fā)揮抗感染的作用［5］。Vanhoutte F等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，TLR2也能和TLR3結(jié)合共同作用而增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。

TLRs家族所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與果蠅Toll類似，當(dāng)PAMPs分子作用于細(xì)胞膜表面的TLRs分子后，輔助分子髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MyD88）C端Toll同源區(qū)與TIR區(qū)結(jié)合，MyD88的N端死亡區(qū)與IL－1受體相關(guān)激酶（IL－1receptor assoeiated kinase，IRAK）作用，經(jīng)一系列反應(yīng)最終引起NF－B的活化，NF－B激活后即可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF、IFNγ、IL6等的合成釋放。如將TLR2的TIR區(qū)去除C端的13或141個(gè)氨基酸，都將使TIR區(qū)喪失信號(hào)傳導(dǎo)能力。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞受到LPS刺激后，TLR2的胞外段即發(fā)生寡聚化，接著與細(xì)胞膜表面CD14形成復(fù)合體，將LPS信息傳至胞內(nèi)段即TIR區(qū)［1］。

通過(guò)對(duì)人及小鼠的TLR2研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因與一些炎性傳染疾病有關(guān)。Matsumura T等［11］報(bào)道，TLR2在人體正常肝組織表達(dá)程度較低或無(wú)表達(dá)，但某些炎性或前炎性因子可上調(diào)TLR2的表達(dá)，其中白介素la、表皮生長(zhǎng)因子β可以上調(diào)鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞TLR2的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)TLR2蛋白第753位的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０放c白種人的敗血病發(fā)病率、急性風(fēng)濕熱的發(fā)病、風(fēng)濕性心臟病有關(guān)聯(lián)。另外，TLR2還和心血管疾病、腦膜炎等疾病有關(guān)［12］。大量證據(jù)進(jìn)一步表明TLR2信號(hào)通路還與病原微生物引起的及非炎癥疾病相關(guān)，如動(dòng)脈硬化癥和哮喘［13］。研究又發(fā)現(xiàn)TLR2參與β細(xì)胞的調(diào)亡并且誘導(dǎo)自身免疫性糖尿病的發(fā)生［14］。Tunheim G等［15］又證明了TLR2能夠有希望成為一種新型的重組免疫球蛋白疫苗用于預(yù)防和治療一些自身免疫性疾病。關(guān)于TLR2基因的多態(tài)性，特別是TLR2基因多態(tài)性與感染性疾病和腫瘤易感性之間的關(guān)系更是深入研究的熱點(diǎn)?？梢?jiàn)TLR2在免疫應(yīng)答反應(yīng)中的重要性。因此，水牛TLR2分子結(jié)構(gòu)與功能研究可能對(duì)其疫病防控有重要意義。

本研究克隆的水牛TLR2cDNA大小為2 455 bp，含一個(gè)大小為2 355bp的開(kāi)放閱讀框，共編碼784個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為90.2ku。序列分析發(fā)現(xiàn)，TLR2ORF序列與GenBank上登載的水牛核苷酸序列同源性為99.53%，說(shuō)明本試驗(yàn)成功的克隆了水牛TLR2cDNA。其ORF序列與黃牛、馬、人、黑猩猩等物種的核苷酸序列同源性在80%以上，具有很高的相似性，這說(shuō)明TLR2在生物進(jìn)化過(guò)程中具有較強(qiáng)的保守性。分子跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TLR2屬I型跨膜受體，分為胞外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三部分。其N端胞外區(qū)具有特征性的富亮氨酸重復(fù)基序（LRR），在LRR區(qū)域的C端側(cè)翼為富半胱氨酸區(qū)域（LRRCT），LRRCT緊隨的是跨膜區(qū)和C端的包含144個(gè)氨基酸的TIR區(qū)域。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)TLR2分子在LRR區(qū)和TIR區(qū)富含磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明這兩個(gè)區(qū)域的磷酸化對(duì)TLR信號(hào)通路有十分重要的作用，它們作為TLR2重要的功能區(qū)域，值得在不同層次上加以深入研究。

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