楊沛沛，王天奇，閆文朝，代 娟

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003）

結(jié)腸小袋蟲(chóng)?。˙alantidiosis）是由結(jié)腸小袋蟲(chóng)（Balantidium coli）感染引起的人獸共患寄生蟲(chóng)病，呈世界性分布，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，可引起宿主腹瀉，結(jié)腸潰瘍和穿孔［1－2］。目前已知人及33種動(dòng)物可感染該蟲(chóng)。豬結(jié)腸小袋蟲(chóng)感染非常普遍，感染率高達(dá)20%～100%［3－4］。臨床上，可用于抗結(jié)腸小袋蟲(chóng)的藥物主要是硝基咪唑類(lèi)化合物，由于它們有“三致”作用，我國(guó)農(nóng)業(yè)部已明確規(guī)定食品動(dòng)物禁用或限用這類(lèi)藥物［5］。因此，如何控制食品動(dòng)物如豬的結(jié)腸小袋蟲(chóng)病成為一個(gè)難題，為此，我們利用體外急性毒性試驗(yàn)方法中的機(jī)率單位法［6－7］，測(cè)定了常山、五倍子、二花和烏梅4種中藥體外抗結(jié)腸小袋蟲(chóng)的半數(shù)致死濃度，并進(jìn)行了比較，為開(kāi)發(fā)應(yīng)用抗結(jié)腸小袋蟲(chóng)中藥品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)種 采自豫西地區(qū)某養(yǎng)豬場(chǎng)自然發(fā)病的病豬糞便，直接鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量滋養(yǎng)體。

1.1.2 試劑及藥品 DMEM 培養(yǎng)基，10.0g裝，Lot№1342967，GIBCOTM；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為100424；碳酸氫鈉，西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)為100623，分析純；可溶性淀粉，北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基廠生產(chǎn)，批號(hào)100517，用前取適量裝入潔凈小瓶中高壓滅菌；常山、五倍子、烏梅、二花購(gòu)自北京同仁堂（洛陽(yáng)）有限公司；20g／L甲硝唑注射液，河南華利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H41020499。

1.2 方法

1.2.1 DMEM培養(yǎng)液配制 用高壓滅菌雙蒸餾水溶解DMEM培養(yǎng)基，每1 000mL加碳酸氫鈉3.7 g。培養(yǎng)基用G6濾器過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们案鶕?jù)需要用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7.0。

1.2.2 結(jié)腸小袋蟲(chóng)培養(yǎng) 取經(jīng)嚴(yán)格清洗和滅菌的小安瓿，每個(gè)小安瓿內(nèi)加DMEM培養(yǎng)液2.55mL、滅能小牛血清0.45mL、消毒淀粉40mg、青霉素、鏈霉素1萬(wàn)單位／mL。取糞便樣品少許接種于培養(yǎng)液內(nèi)，在28℃條件下培養(yǎng)48h，鏡檢后發(fā)現(xiàn)大量活動(dòng)滋養(yǎng)體后用于試驗(yàn)研究，不用于試驗(yàn)時(shí)傳代轉(zhuǎn)接［8］。

1.2.3 中草藥水提取物的制備 將備用的中藥各加10倍體積的水浸泡3h，之后用砂鍋文火煎煮2 h，將煎液用篩網(wǎng)濾出，余渣再加10倍體積水，文火煎煮2h，合并兩次煎液，再用文火濃縮到每mL相當(dāng)生藥0.5g。最后將煎好的藥液盛入瓶中加蓋高壓滅菌，冷卻后放入2℃～8℃條件下備用［9－10］。

1.2.4 中藥抗結(jié)腸小袋蟲(chóng)半數(shù)致死濃度的測(cè)定用DMEM培養(yǎng)液將中藥煎液稀釋成所需終濃度梯度的兩倍，取24個(gè)滅菌小安瓿，每安瓿加培養(yǎng)48h的蟲(chóng)體懸液1mL，之后將其分為8組，每組3個(gè)平行。最后每個(gè)小安瓿內(nèi)加入相應(yīng)濃度的中藥煎液1mL。8組小安瓿內(nèi)中除對(duì)照外，其余7個(gè)為不同濃度中藥煎液。上述小安瓿加蓋后放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中，2、6、12h后取出觀察。觀察時(shí)，將每個(gè)小安瓿內(nèi)液體充分混勻，吸取40μL滴于載玻片上，加蓋玻片，于100×鏡暗視野下計(jì)數(shù)30個(gè)視野活蟲(chóng)數(shù)。試驗(yàn)時(shí)以甲硝唑?yàn)橘|(zhì)控藥物，以同樣方法檢測(cè)其不同時(shí)間的半數(shù)致死濃度。因沒(méi)有現(xiàn)有可參考的文獻(xiàn)資料，試驗(yàn)所使用的藥物濃度梯度是在多次預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的［11］。

1.2.5 數(shù)據(jù)計(jì)算 采用機(jī)率單位法計(jì)算LC50及其95%置信限［11］。以對(duì)照組（藥物濃度為0）3個(gè)平行樣品試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所查獲的平均活蟲(chóng)數(shù)（30個(gè)視野）為X，以相應(yīng)試驗(yàn)系列各濃度組3個(gè)平行樣品，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所查獲的平均活蟲(chóng)數(shù)（30個(gè)視野）為Y，將（X－Y）／X的值換算為百分?jǐn)?shù)，就是該濃度條件下的蟲(chóng)體死亡率。根據(jù)死亡百分率－機(jī)率單位換算表，將不同濃度下死亡百分率換算成死亡機(jī)率單位。在Excel圖表系統(tǒng)下，以橫軸表示濃度對(duì)數(shù)，以縱軸表示機(jī)率單位，作XY散點(diǎn)圖。順著所獲得的散點(diǎn)作一趨勢(shì)線（直線），并自動(dòng)獲得該直線的回歸方程及決定系數(shù)R2。經(jīng)X2檢驗(yàn)回歸線符合要求后，可利用該方程求出死亡機(jī)率單位5（50%死亡率）時(shí)的藥物濃度對(duì)數(shù)，查反對(duì)數(shù)表就可獲得LC50。同時(shí)，利用回歸方程的斜率求出lgLC50的標(biāo)準(zhǔn)誤Sm，則lgLC50的95%置信限＝lgLC50±1.96Sm，最后查反對(duì)數(shù)表就可獲得LC50的95%置信限。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸小袋蟲(chóng)的死亡過(guò)程

在新鮮糞便樣品或培養(yǎng)液中的結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體可借助體表纖毛的擺動(dòng)作快速旋轉(zhuǎn)式前進(jìn)或原地轉(zhuǎn)動(dòng)。前行中的蟲(chóng)體遇到障礙物可迅速掉頭；遇到適當(dāng)?shù)目p隙，可改變體形通過(guò)［8］。滋養(yǎng)體在一定濃度的藥物作用下，運(yùn)動(dòng)能力逐漸減弱，或原地緩慢旋轉(zhuǎn)，或僅胞口處的纖毛小幅度擺動(dòng)。死亡的滋養(yǎng)體不能運(yùn)動(dòng)，體表斜縱列纖毛變直，與體表接近垂直，表膜隨后破裂或消失，內(nèi)容物脫出（圖1）。

圖1 結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體死亡狀態(tài)（400×）Fig.1 Death state of trophozoite of Balantidium coli（bar＝50mm）

2.2 半數(shù)致死濃度的測(cè)定結(jié)果

表1～表5分別顯示4種中藥及甲硝唑不同時(shí)間對(duì)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的毒性效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。回歸方程經(jīng)X2檢驗(yàn)后，X20.05＞X2，說(shuō)明濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位之間的線性關(guān)系均成立，并根據(jù)回歸方程最終確定了各種藥物不同時(shí)間的LC50及其95%置信限。圖2顯示4種中藥及甲硝唑不同時(shí)間抗結(jié)腸小袋蟲(chóng)半數(shù)致死濃度的比較，2h的LC50由低到高排序?yàn)槲灞蹲印⒊Ｉ?、烏梅、二花?h和12h的LC50排序均為五倍子、烏梅、常山、二花。

表1 常山水提取物對(duì)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Table 1 Toxicity of water extracts from Dichroa febrifugaagainst B.coli

表2 五倍子水提取物對(duì)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Table 2 Toxicity of water extracts fromGalla chinensis against B.coli

表3 烏梅水提取物對(duì)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Table 3 Toxicity of water extracts fromPrunus mume against B.coli

表4 二花水提取物對(duì)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Table 4 Toxicity of water extracts fromLonicera japonica against B.coli

表5 甲硝唑?qū)Y(jié)腸小袋蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Table 5 Toxicity of metronidazole against B.coli

3 討論

結(jié)腸小袋蟲(chóng)包括滋養(yǎng)體和包囊兩個(gè)階段，人及動(dòng)物食入包囊后，囊壁在消化液作用下被破壞，滋養(yǎng)體脫出，其以結(jié)腸及盲腸內(nèi)的淀粉、細(xì)菌及脫落的細(xì)胞為食，并以橫二分裂法及出芽生殖方式繁殖［8］，當(dāng)人和動(dòng)物免疫力下降或腸道黏膜受損時(shí)侵入腸黏膜而引起發(fā)?。?2－13］。藥物對(duì)滋養(yǎng)體有殺滅作用，而對(duì)包囊無(wú)效［14］。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道未發(fā)現(xiàn)結(jié)腸小袋蟲(chóng)對(duì)藥物有抗性［3］，但有關(guān)結(jié)腸小袋蟲(chóng)藥物敏感性的研究較少，更未見(jiàn)關(guān)于中藥抗蟲(chóng)濃度的研究。

本試驗(yàn)利用機(jī)率單位法，首次檢測(cè)了4種中藥抗結(jié)腸小袋蟲(chóng)的半數(shù)致死濃度，為應(yīng)用中藥預(yù)防控制該蟲(chóng)引起的感染提供了科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，4種中藥中，常山的2h和6h的LC50接近，且二者LC50的95%置信限有重疊，說(shuō)明其對(duì)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的毒性具有較好的速效性。而其他3種中藥3個(gè)時(shí)間的LC50差異較大，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，LC50大幅度減小，與甲硝唑的作用類(lèi)似，沒(méi)有速效性。LC50越小，說(shuō)明藥物的作用效果越好，五倍子、常山和烏梅的不同時(shí)間的LC50均小于相應(yīng)時(shí)間二花的LC50，可作為抗結(jié)腸小袋蟲(chóng)候選中藥。中藥水提取物是多種成分的混和物，在分離出單體之前難以確定是哪一種成分在起作用，也就無(wú)從知道其作用方式［9－10］。今后要用多種溶劑提取其有效成分，并進(jìn)行試驗(yàn)，以確定上述中藥抗結(jié)腸小袋蟲(chóng)的作用成分及其作用機(jī)制，并利用動(dòng)物試驗(yàn)尋找恰當(dāng)?shù)膭┝亢蛣┬汀?/p>

圖2 不同藥物對(duì)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的半數(shù)致死濃度比較Fig.2 Comparison of LC50of different medicines against B.coli

［1］蔣金書(shū).動(dòng)物原蟲(chóng)病學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出社，2000：329－333.

［2］Solaymani－Mohammadi S，Petri W A.Zoonotic implications of the swine－transmitted protozoal infections［J］.Vet Parasitol，2006，140（3－4）：189－203.

［3］Schuster F L，Lynn R A.Current world status ofBalantidiumcoli［J］.Clini Microbiol Rev，2008，21（4）：626－638.

［4］王天奇，董發(fā)明，楊光忠，等.洛陽(yáng)地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)感染情況調(diào)查及分析［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2007，24（8）：34－36.

［5］汪繼倉(cāng)，馬素英，王大菊，等.氣相色譜一離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定豬肌肉中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，

2008，39（12）：1772－1778.

［6］劉曉強(qiáng)，劉海俠，梁 拓，等.四種抗菌藥物對(duì)鯽魚(yú)苗的急性毒性試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（1）：49－53.

［7］王天奇，丁 軻，閆文朝，等.三種藥物對(duì)結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)的體外急性毒殺試驗(yàn)［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（3）：44－46.

［8］閆文朝，王天奇，丁 軻，等.DMEM培養(yǎng)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的正交試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（8）：34－37.

［9］蔣亞莉，李 蓉.中藥現(xiàn)代提取技術(shù)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（9）：105－107.

［10］鉏 超，張其中，羅 芬，等.20種中草藥殺滅離體小瓜蟲(chóng)的藥效研究［J］.淡水魚(yú)業(yè)，2010，40（1）：55－60.

［11］周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗(yàn)方法［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989：114－122.

［12］Ponce－Gordo F，Jimenez－Ruiz E.Tentative identification of the species ofBalantidiumfrom ostriches（Struthiocamelus）asBalantidiumcolilike by analysis of polyme－rphic DNA［J］.Vet Parasitol，2008，157：41－49.

［13］王天奇，竇 剛，閆文朝，等.基于ITS1－5.8SrRNA－ITS2序列的豬源結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)種群特征分析［J］.微生物學(xué)報(bào)，2011，51（6）：828－834.

［14］Bilal C Q，Khan M S，Avais M，et al.Prevalence and chemotherapy ofBalantidiumcoliin cattle in the River Ravi region，Lahore（Pakistan）［J］.Vet Parasitol，2009，163（1－2）：15－17.