張芙蓉，屠慧渭，錢 波，孫 何，金立方

（紹興文理學院生命科學學院，浙江紹興 312000）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于多種組織中，骨髓是最常用的MSCs體外分離培養(yǎng)的組織來源。MSCs具有較強的增殖潛能和多向分化潛能，同時在造血支持和免疫調控等方面也發(fā)揮著重要的作用［1－2］。此外，MSCs可以自體取材，體外擴增，具有良好的可塑性也不涉及倫理爭議，是組織工程和細胞治療的理想種源細胞。MSCs在體外可分化為脂肪、成骨、軟骨等中胚層的組織細胞，近10年的研究顯示MSCs還可跨胚層分化為內胚層的肝樣細胞，試驗顯示移植后的MSCs能改善肝臟疾病動物模型的臨床癥狀［3－8］。若干MSCs肝內移植示蹤方法已有應用，如Y染色體探查應用于不同性別間細胞移植［9］，ALU序列應用于不同種屬間細胞移植［10］，以及應用cre－Lox方法結合GFP標記細胞顯像等放射性同位素標記細胞移植后的肝內分布［11］。這些方法的確立可在不同程度上說明移植細胞的存活和增殖情況，同時為進一步評價骨髓MSCs移植對于肝臟再生和功能恢復的作用提供依據(jù)。但這些方法也存在一定的缺陷，如Y染色體只能應用于不同性別間細胞移植的探查，而綠色熒光蛋白（green flurescence protein，GFP）示蹤細胞熒光較弱，影響觀察效果。攜帶有增強型綠色熒光蛋白（enhanced green flurescence protein，EGFP）的慢病毒載體轉染細胞時不但可整合入宿主細胞染色體內，具有轉染穩(wěn)定、安全無毒等優(yōu)點，且熒光強度高，可直接觀察。兔子是重要的人類肝臟疾病動物模型，本試驗將帶有EGFP的慢病毒載體感染兔骨髓MSCs，觀察其感染效率及細胞活力，示蹤其在肝損傷兔受體肝組織內的分布和整合，進一步為MSCs治療提供理論依據(jù)和試驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭大白兔，體重2.5kg左右，年齡5個月～8個月，雌雄不分，來自紹興文理學院實驗動物基地，動物飼養(yǎng)繁殖及試驗操作處理符合國際試驗動物評估和認證委員會（AAALAC）及紹興文理學院動物倫理委員會的標志和規(guī)定，觀察1周后正常的新西蘭大白兔用于試驗研究。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離 無菌條件下，對兔剪毛、備皮、碘伏消毒后，利用骨髓穿刺針垂直進針，直至感覺有突破或者落空感，證明針尖已經進入骨髓腔，拔出針芯，利用事先肝素化的10mL無菌注射器回抽，收集一定量的兔股骨骨髓。迅速轉移到實驗室，無菌條件下，按骨髓液與紅細胞裂解液（Tiangen公司）為1∶3的比例加入紅細胞裂解液，充分混勻，待紅系細胞充分裂解后放入離心機，配平后以1 200 r／min離心5min后棄掉上清。再加入無血清培養(yǎng)基重懸沉淀液，以1 200r／min離心5min后棄掉上清，最后加入含100mL／L FBS（Hyclone公司）的α－MEM培養(yǎng)液（Invitrogen公司）重懸細胞。待接種培養(yǎng)。

1.2.2 MSCs的培養(yǎng) 將上述重懸的細胞以1×105cells／mL的密度接種于鋪蓋有明膠（Sigma－Aldrich公司）的塑料培養(yǎng)瓶，α－MEM＋10mL／L FBS＋青鏈雙抗（Sigma－Aldrich公司），在37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司）中培養(yǎng)。倒置顯微鏡（Nikon ECLIPSE公司）下每天觀察細胞生長情況并記錄。1d后半換液去除未貼壁細胞的同時并去除未貼壁細胞。待細胞匯合至80%以上時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸去，PBS液沖洗兩次，用0.5g／L的胰酶（Sigma－Aldrich公司）＋0.1 g／L的EDTA（Sigma－Aldrich公司）的消化液消化3 min～5min，待消化基本完全，輕輕利用移液管收集細胞至離心管，1 200r／min的速度離心5min后棄掉上清，用含100mL／L FBS的α－MEM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)板計數(shù)后，1∶2或者1∶3的比例傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況換液。

1.2.3 MSCs的鑒定

1.2.3.1 細胞表面分子CD73和CD105測定 培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質干細胞消化后取1×106個細胞，分成4組，40mL／L多聚甲醛固定（Sigma－Aldrich公司）10min～20min，然后分別用帶有PE熒光標記的CD73（SH3）（BD Pharmingen公司）和CD105（SH2）（BD Pharmingen公司）抗體孵育30 min，以1 200r／min的速度離心后并用PBS液重新懸浮細胞，流式細胞儀分析（BD Biosciences公司）。

1.2.3.2 細胞分化鑒定

（1）成骨誘導分化及鑒定 取第4代細胞，4孔培養(yǎng)板每孔接種2×104個細胞，待80%～90%融合時換成成骨分化培養(yǎng)基，包括0.1μmol／L的地塞米松（Sigma－Aldrich公司）、50mg／L的維生素C（Sigma－Aldrich 公 司 ）、10mmol／L 的 β－磷 酸 甘 油 鈉（Sigma－Aldrich公司）進行聯(lián)合誘導培養(yǎng)，隔日換液，培養(yǎng)14d和21d后，用鈣鈷法進行堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡下進行觀察。

（2）成脂誘導分化及鑒定 取第4代細胞，4孔培養(yǎng)板每孔接種2×104個細胞，24h后換成脂肪分化培養(yǎng)基，含100mL／L FBS的 L－DMEM（Invitrogen公 司），0.25μmol／L 地 塞 米 松 （Sigma－Aldrich公司），50μmol／L吲哚美辛（Sigma－Aldrich公司），0.5mmol／L 3－異丁基－1－甲基黃嘌呤（Sigma－Aldrich公司），10mg／L 牛胰 島素（Sigma－Aldrich公司），每3d換液，誘導2周后，細胞經PBS洗滌，40mL／L多聚甲醛固定30min，進行油紅染色檢測脂肪沉積，倒置焦顯微鏡下進行觀察。

1.2.4 MSCs的轉染 在無抗生素條件下，將攜帶有EGFP報告基因的慢病毒載體（Invitrogen公司生產，由中國科學院昆明動物研究所惠贈，病毒滴度為4.8×107TU／mL）以不同 MOI值（病毒數(shù)／細胞數(shù)）添加到培養(yǎng)基中，與MSCs共培養(yǎng)8h，換新鮮培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，LSM 5105META）下進行觀察。

1.2.5 兔急性／亞急性肝功能衰竭模型的建立及MSCs的移植 12只新西蘭成年大白兔（雌5只，雄7只），兔耳緣靜脈注射D﹣氨基半乳糖2.5mmol／kg，建造急性／亞急性肝功能衰竭模型。24h后耳緣靜脈內注射0.1mL MSCS細胞液，濃度為1×108／mL。在移植后第3天（處死2只）、第7天（處死3只）和第15天（處死3只）處死兔子，收集肝組織，5 μm厚冰凍組織切片或HE染色，激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（SEM）進行表示。統(tǒng)計分析采用SPSS 10.0軟件進行One－Way ANOVA分析。P＜0.05為差異性顯著。

2 結果

2.1 兔MSCs體外的穩(wěn)定傳代

兔MSCs在含有100mL／L胎牛血清的培養(yǎng)基中可在24h內貼壁生長，外觀呈梭形（圖1A），經過48h的靜止期后開始快速增殖，呈螺旋狀，倍增時間約為30h，約7d～8d可達80%～90%的匯合（圖1 B）。細胞可在體外連續(xù)傳10代以上，仍具有增殖和分化的潛能。

2.2 兔MSCs表面抗原分析

經免疫細胞化學分析，體外培養(yǎng)的MSCs表達CD105（圖2A）和CD73（圖2B），符合間充質干細胞的表面抗原特征。

2.3 兔MSCs體外分化能力鑒定

MSCs在脂肪細胞分化培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)后可見細胞質內出現(xiàn)微小、分散的脂滴，2周后脂滴增大并匯合。多聚甲醛固定，油紅染色，脂滴可被油紅染色（圖3A），說明MSCs具備向脂肪細胞分化的潛能。

MSCs在成骨細胞分化培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)中培養(yǎng)可見細胞聚集，21d后，多聚甲醛固定，聚集區(qū)可被茜素紅染色（圖3B），說明MSCs具備向骨細胞分化的潛能。

圖1 骨髓間充質干細胞的形態(tài)（100×）Fig.1 Morphology of BM－MSC（100×）

圖2 MSCs表面抗原分析Fig.2 Analysis of surface antigens of MSCs

2.4 兔MSCs的轉染結果

慢病毒轉染后培育48h后，激光共聚焦顯微鏡觀察轉染效率（圖4B）。不同感染復數(shù)（multiplicit of infection，MOI）對 MSGS轉染效率見表1，其中當MOI值等于6時可使81.25%的細胞轉染EGFP標記，達到最高的轉染效率，且該標記不會隨細胞分裂丟失，可穩(wěn)定表達。

圖3 MSCs誘導分化為脂肪細胞（A，200×）和成骨細胞（B，100×）Fig.3 MSCs induced to differentiate into fat cells by oil red staining（A，200×）and into osteoblasts by alizarin red staining（B，100×）

圖4 攜帶有EGFP報告基因的慢病毒載體成功轉染MSCs（B），A為B相應的可見光圖片，200×Fig.4 MSCs were transected by lentiviral vector with EGFP reporter gene（B）and A is phase contrast microscopy of B，200×

表1 不同的MOI值下的轉染效果Table 1 Different MOI values have different transfection efficiency

2.5 MSCs的肝內觀察

耳緣靜脈注射D﹣氨基半乳糖3d后，處死兔子，肝組織切片HE染色結果顯示正常肝組織結構受到破壞，肝組織多個區(qū)域肝細胞壞死或凋亡（圖5 A，白色箭頭所指的區(qū)域），部分兔子出現(xiàn)死亡或昏迷等臨床現(xiàn)象，表明兔肝組織發(fā)生不同程度的急性／亞急性肝衰。通過冰凍切片的觀察，可在受體肝組織內發(fā)現(xiàn)綠色熒光的細胞。移植的第3天在受體肝組織內可見少量的EGFP標記的供體細胞（圖5 B），移植的第7天EGFP標記的細胞數(shù)量有所增加（圖5C），移植的第15天可見大量的EGFP標記的細胞（圖5D）。細胞熒光強度并不隨移植的時間延長而減弱。

圖5 兔急性／亞急性肝衰竭模型的建立（100×）及供體MSCs在受體肝組織內的分布（200×）Fig.5 Establishment of acute／subacute liver failure of rabbit model and observation of transplanted MSCs in receipt liver

3 討論

應用成熟肝細胞移植治療肝臟疾病已有10多年時間，大多數(shù)臨床病例可以看到癥狀改善，并維持一年以上，但成熟肝細胞來源有限，很大程度限制了其應用，而以干細胞為來源細胞移植相比成熟肝細胞有許多優(yōu)勢。MSCs是中胚層來源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可分化為具有功能的組織細胞并應用于器官損傷的治療。近期研究顯示，在特定條件下，MSCs可被誘導分化為肝細胞或類肝樣細胞。國內外眾多學者都已經證實移植的MSCs可定居于肝臟并分化為肝細胞或類肝樣細胞，應用骨髓MSCs治療肝病的臨床試驗近幾年已有少量病例報道，證實骨髓MSCs分化來源的肝細胞移植可以降低死亡率，改善肝功能［3－8］。

若干體內移植細胞示蹤方法已有應用，如Y染色體探查應用于不同性別間細胞移植，ALU序列探查和熒光原位雜交技術（FISH）應用于不同種屬間移植、放射性同位素標記移植細胞以及應用GFP標記細胞顯像。這些方法的確立可在不同程度上說明移植細胞的存活和增殖情況，但均存在不同程度的缺陷。Y染色體探查及ALU序列探查因其自身的特點而無法廣泛使用［9－14］。與其他病毒載體系統(tǒng)相比，慢病毒具有能夠轉染分裂和非分裂的細胞并穩(wěn)定表達治療基因，無明顯免疫反應等特點，同時能偶轉染廣泛的組織、能夠被濃縮成高滴度等優(yōu)點。EGFP作為報告基因具有觀察簡單方便和直觀的優(yōu)點，EGFP在470nm波長處可吸收激發(fā)光，在510 nm發(fā)射綠色熒光，只要有足夠的表達，可以直接在冰凍的組織切片下觀察，甚至直接在活體狀態(tài)下觀察，克服了傳統(tǒng)GFP方法及其他報告基因需要底物及維持時間短的缺點［15］。本研究結果表明EGFP標記的細胞在受體肝組織內呈一定的分布，在不使用GFP抗體的情況下可在冰凍組織切片里直接觀察，是一種簡單高效的示蹤細胞的方法。

本研究利用攜帶EGFP報告基因的慢病毒載體轉染兔骨髓來源MSCs，轉染后的兔骨髓MSCs的生長狀態(tài)、增殖與轉染前基本一致，說明慢病毒載體攜帶EGFP轉染在一定范圍內不影響兔骨髓MSCs的生長特性，這與已有的文獻報道基本一致［16－17］。試驗結果還顯示慢病毒轉染效果與轉染MOI值相關，在一定范圍內轉染效率隨MOI值的增大而提高，但超過一定值后，轉染的陽性率反而出現(xiàn)下降。原因可能是使用過高的MOI值（即提高病毒濃度）導致病毒的細胞毒性致使細胞死亡，致使轉染效率降低。

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