趙建英 郝小波 鄭鳳鳴 黃素珍 吳含青 郭大東

穴位埋線對實驗自身免疫性葡萄膜炎大鼠眼部炎癥影響的研究

趙建英1郝小波1鄭鳳鳴2黃素珍3吳含青4郭大東5

目的探討穴位埋線療法對治療EAU大鼠眼部炎癥情況的影響變化。方法Lewis大鼠隨機分為對照組3只、EAU組24只和穴位埋線(ACE)組24只。除對照組外,均使用光感受器間維生素A結合蛋白(IRBP)免疫造模形成EAU組,ACE組為造模成功后次日進行穴位埋線,分別觀察眼前段炎癥變化并記錄免疫后9d、13d、18d及23d不同時間段的眼部房水蛋白量。結果造模后13d是炎癥的高峰期,該時段模型鼠眼前段炎癥及房水蛋白量均達到高峰,EAU組房水蛋白濃度為41.15±3.91mg/ml,ACE組13d房水蛋白濃度為21.85±1.70mg/m;不僅如此,在觀察的4個時間段中,ACE組房水蛋白量均低于EAU組(P<0.01)。結論穴位埋線療法能減輕EAU大鼠眼前段炎癥反應,同時還可以減輕由于眼前段炎癥導致的房水蛋白量的急劇升高,因此該療法在調節(jié)免疫狀態(tài)方面是一種有積極有效的綠色療法。

穴位埋線; 自身免疫性葡萄膜炎; 實驗; 大鼠; 房水蛋白

葡萄膜炎是一種多發(fā)于青壯年的眼病,在致盲眼病中占有重要地位,已引起世界范圍內的重視[1]。由于該病是一種自身免疫性眼病,治療上以免疫抑制療法為主,包括激素和激素替代治療,長期使用副作用明顯[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥觀點認為,免疫系統(tǒng)是機體陰陽平衡的調節(jié)系統(tǒng)。臨床發(fā)現(xiàn)運用穴位埋線療法對葡萄膜炎免疫調節(jié)有一定的治療作用[3,4],因此借助于廣泛應用于人類自身免疫性葡萄膜炎發(fā)病機理及藥物治療的研究[5,6]的動物模型——視網(wǎng)膜蛋白作為抗原誘發(fā)的實驗性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis,EAU)來進行試驗研究,本研究旨在研究穴位埋線(Acupoint catgut embedding,ACE)對EAU大鼠眼部炎癥的影響,為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及喂養(yǎng)

6～8周齡雌性SPF級Lewis大鼠,體重140～160g(北京維通利華實驗動物有限公司,大鼠許可證號:SCXK(京)2017-0001)。實驗大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院試驗動物房。實驗研究方案、實驗動物的應用及喂養(yǎng)均得到廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗室動物管理和使用委員會的批準。所有動物均按照視覺與眼科學研究學會中對動物進行眼科與視覺研究實驗的要求飼養(yǎng)與處理。

1.2 主要試劑及儀器

埋線材料及主要實驗試劑、儀器:埋線材料由北京任曉艷穴位埋線醫(yī)療研究中心提供(專利號:2004200665990,京藥監(jiān)械(準)字2005第2270643號,京藥管械生產許20040062號);光感受器間維生素A結合蛋白[IRBP,1177-1191,氨基酸序列:ADGSSWEGVGVVPDV,(上海生工生物工程股份有限公司合成)];結核菌素[tuberculin,TB(美國Difco公司)];CFA[完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)];數(shù)碼眼前節(jié)照相(日本TOPCON公司);K5600超微量分光光度計(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)。

1.3 方法

動物分組與造膜 分組: 將51只大鼠按隨機數(shù)字表將隨機分為空白對照組3只(注射生理鹽水),模型組(造模后無任何干預措施),穴位埋線組(造模后第2天經(jīng)行穴位埋線),每組各24只。造模: Lewis大鼠在裂隙燈下排除其他眼部疾病,在動物房飼養(yǎng)1周后進行造模。參照文獻[7-9]方法按每只IRBP(光感受器間維生素A類結合蛋白)100ug,TB(結核桿菌)100ug,CFA(完全弗氏佐劑)150ul,PBS(磷酸緩沖鹽溶液)150ul制備乳糜液。注射麻醉后分別于大鼠雙后足墊及脊柱正中兩旁皮下,共4個部位建立實驗性自身免疫性葡萄膜炎動物模型(EAU)。②穴位埋線 大鼠穴位的選擇依據(jù)《實驗針灸學》及華興邦等所著大鼠穴位圖譜[10,11]。分別選取脾俞:第12胸椎下兩旁,肋間,左右側各一穴;腎俞:第2腰椎下兩旁,左右側各一穴。③選穴 首先對照大鼠解剖圖譜選取相應穴位,尓后將大鼠麻醉后處死進行解剖學上進一步確認的前期準備,最終選取穴位后標記。④消毒 進針前該區(qū)域備皮及碘伏消毒。⑤進針 將1cm左右羊腸線推入相應穴位皮下至肌層,線頭不外露,無菌棉簽按壓針孔處止血。每穴1 針。⑥注意事項 埋線后立即更換干燥清潔墊料。⑦EAU大鼠眼部炎癥觀察及組織病理學檢查 免疫后每天定時通過數(shù)碼眼前節(jié)照相機觀并記錄察EAU組和埋線組大鼠眼部炎癥情況。參照文獻[12]方法對眼部炎癥進行分級。⑧EAU大鼠房水蛋白測量及血清白蛋白、球蛋白檢驗 大鼠均在第9d、13d、18d、23d分別給予前房穿刺,虹吸管收集房水,分別注入無菌EP管中,使用K5600超微量分光光度計進行蛋白濃度檢測;同時經(jīng)心臟取血,保存于肝素涂抹的EP管,收集外周血樣本,以3000 r/min,4°離心3min,取上清液,-80°保存待測。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 EAU大鼠眼部炎癥變化(圖1)

通過數(shù)碼眼前節(jié)照相機觀察發(fā)現(xiàn),免疫后5d EAU組和ACE組大鼠開始出現(xiàn)虹膜血管輕度擴張、充血,造模成功后次日進行穴位埋線治療。免疫后5d兩組大鼠眼部均出現(xiàn)明顯的炎癥表現(xiàn),如虹膜血管輕、中度擴張充血、瞳孔縮小及前房混濁,9dEAU組大鼠炎癥評分為2.667±0.577,ACE組大鼠炎癥評分為1±0.5774;12d兩實驗組大鼠均出現(xiàn)最嚴重眼部炎癥表現(xiàn),如虹膜嚴重充血、前房大量纖維蛋白滲出、瞳孔膜閉等,EAU組大鼠炎癥評分為3.667±0.5774,ACE組大鼠炎癥評分為1.333±0.5774,隨后炎癥反應逐漸減輕,至免疫后20d炎癥基本消退。

圖1 同一時間段與埋線組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.2 EAU大鼠房水蛋白變化

房水蛋白定量分析顯示,空白對照組大鼠房水蛋白濃度為2.03±0.33 mg/ml,免疫后9d,EAU組房水蛋白濃度為12.97±2.86mg/ml,ACE組為7.63±0.35mg/ml;免疫后13d房水蛋白量相對達到高峰,EAU組房水蛋白濃度為41.15±3.91mg/ml,埋線組為21.85±1.70mg/ml,隨后房水蛋白濃度開始下降,免疫后18dEAU組房水蛋白濃度為19.03±6.20mg/ml,ACE組為11.69±4.34mg/ml;免疫后23dEAU組房水蛋白濃度為8.34±0.38mg/ml,ACE為6.68±1.64mg/ml。EAU組與ACE組組間各個時間段房水蛋白量均高于空白對照組(P<0.01),不同時間段房水蛋白濃度EAU組均高于ACE組,差異有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。EAU組及ACE組在觀察的4個階段中(F=47.12～81.62),兩組房水蛋白量均顯著高于對照組(P=0.00),組內觀察兩組分別在第13d、18d與9d比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01～0.05),第23d與9d比較無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

圖2

3 討論

通過對EAU大鼠眼部炎癥觀察發(fā)現(xiàn),免疫后13d為炎癥高峰期,該階段可以從眼前段表現(xiàn)及房水蛋白來相互驗證。眼前段表現(xiàn)為前房積膿、重度纖維蛋白滲出、虹膜血管充血嚴重甚至瞳孔膜閉等癥狀;房水蛋白也顯示免疫后13d,前房穿刺取房水較其它階段均困難,分析原因,考慮該階段房水處于相對凝固狀態(tài)、量少[13],EAU組、ACE組房水蛋白濃度不僅高于正常組,而且明顯高于其它觀察階段。

從治療療效分析,通過穴位埋線治療后13d穴位埋線組大鼠眼部炎癥比EAU組減輕,測量大鼠房水蛋白濃度進一步可以證實。免疫后13d、18d及23dACE組均明顯低于EAU組,說明穴位埋線法在減輕大鼠EAU眼部癥狀[14]、減少房水蛋白生成,加速減輕眼部炎癥反應方面有一定的治療作用。

穴位埋線療法是經(jīng)絡理論與現(xiàn)代醫(yī)學相結合的產物,使用可降解生物線體這種異物組織對穴位產生持久而柔和的生理、物理和生物化學的刺激,從而達到協(xié)調臟腑,平衡陰陽,疏通經(jīng)絡,調和氣血,補虛瀉實,扶正祛邪及免疫調節(jié)雙向作用。郝小波提出穴位埋線可適宜用與慢性、頑固性眼病的治療[15]。雖然穴位埋線可以在EAU動物模型中減輕眼部炎癥方面有一定的治療作用,但是查閱相關文獻報道,運用某些中藥[13]可以在造模后20d將造模鼠房水蛋白降低至正常,相比之下穴位埋線暫未發(fā)現(xiàn)具有強效的抗炎效果。考慮到免疫調節(jié)紊亂是導致該病發(fā)生的直接原因,穴位埋線應該是通過多種途徑改善機體自身免疫反應,為此我們應該探尋更多的在調節(jié)自身免疫方面有效的綠色療法,以便臨床上可以在多種有效的療法上相應的自由選擇組合,力求更大效益的為病人服務,進而為自身免疫性葡萄膜炎的治療提供了新的思路,但其發(fā)揮作用的具體相關機制還需要進一步實驗研究。

感謝:山東中醫(yī)藥大學眼科研究所老師給予實驗的幫助和指導。

表1

組間不同時間段資料采用獨立樣本t檢驗,與EAU組比較#P<0.01;組內資料比較采用單因素方差分析ANOVA,各組間的兩兩比較采用LSD檢驗,與9d比較,@P<0.01,*P<0.05

[1] 劉家琦,李鳳鳴.實用眼科學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:8.

[2] 于晉懿,盧弘.非感染性葡萄膜炎的免疫抑制治療[J].眼科新進展,2014,34(7):695-700.

[3] 張馨,郝小波.穴位埋線對慢性葡萄膜炎患者T淋巴細胞亞群的影響[J].南京中醫(yī)藥大學學報,2013,29(2):129-131.

[4] 鄭鳳鳴,郝小波,趙建英.穴位埋線對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎治療作用的研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志,2015,25(5):309-313.

[5] Caspi RR.A look at autoimmunity and inflammation in the eye[J].J Clin Invest,2010,120(9):3073-3083.

[6] Fang CB,Zhou DX,Zhan SX,He Y,Lin Z,Huang C,Li J.Amelioration of experimental autoimmune uveitis by leflunomide in Lewis rats[J].PLoS One,2013,8(4): e62071.

[7] Cortes L.M,Avichezer D,Silver P.B,Luger D,Mattapallil M.J,Chan C.C,Caspi R.R.Inhibitory peptide analogs derived from a major uveitogenic epitope protect from antiretinal autoimmunity by inducing type 2 and regulatory T cells[J].J Leukoc Bio,2008,84(2):577 - 585.

[8] Cui Y,Shao H,Sun D,Kaplan HJ.Regulation of interphotoreceptor retinoid-binding protein(IRBP)-specific Th1 and Th17 cells in anterior chamber-associated immune deviation(ACAID)[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(12):5811-5817.

[9] Tian Q,Bi H,Cui,Y,Guo D,Xie X,Su W,etal.Qingkailing injection alleviates experimental autoimmune uveitis in rats via inhibiting Th1 and Th17 effector cells[J].Biol Pharm Bull,2012,35(11):1991-1996.

[10] 李忠仁,新世紀全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材[M].中國中醫(yī)藥出版社,2003:329.

[11] 華興邦,李辭蓉,周浩良,等.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991,1:1-4.

[12] Agarwal RK,Silver PB,Caspi RR.Rodent models of experimental autoimmune uveitis[J].MethodsMolBiol,2012,900:443-469.

[13] 唐凱,郭大東,張蓮,司俊康,杜宇翔,畢宏生.龍膽瀉肝湯對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎的治療作用[J].眼科新進展,2015,35(4):305-309.

[14] 鄭鳳鳴,郝小波,趙建英,張蓮,郭大東.穴位埋線對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎治療作用的研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志,2015,25(5):309-313.

[15] 郝小波.眼病中醫(yī)外治[M].南寧:廣西民族出版社,2014:36-39.

Effectofacupointcatgutembeddingonocularinflammationinexperimentalautoimmuneuveitisrats

ZHAOJian-ying1,HAOXiao-bo1,ZHENGFeng-ming2,HUANGSu-zhen3,WUHan-qing4，GUODa-dong5

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning,Guangxi,530023;2.ChineseMedicineHospitalShangyuShaoxing,Shaoxing,Zhejiang,312300;3.DongguanHumenZhongYiyuan,Dongguan,Guangdong,523902;4.GuangxiInternationalZhuangHospital,Nanning,Guangxi,530001;5.EyeInstituteofShandongUniversityofTCM,Jinan,Shandong,250002)

ObjectiveTo explore the effect of acupoint catgut embedding therapy on ocular inflammation in EAU rats.MethodsLewis rats were randomly divided into control group(n=3),EAU group(n=24)and acupoint catgut embedding(ACE)group(n=24).(IRBP)was used to form EAU group.The ACE group was treated with acupoint catgutation after the success of the model.The changes of the anterior segmental inflammation were observed and 9 days after the immunization.13d,18d and 23d at different times of eye aqueous protein.ResultsT The peak of inflammation and the amount of aqueous protein in the model group were 41.15 ± 3.91mg / ml,and the aqueous protein concentration in the ACE group was 21.85 ± 1.70mg / m;not only that,in the observation of the four time periods,ACE group of aqueous protein levels were lower than EAU group(P<0.01).ConclusionAcupoint catgut embedding therapy can reduce the anterior segment of the EAU rat inflammatory response,but also can reduce the anterior segment of the inflammation caused by the rapid increase in the amount of aqueous humor protein,so the regulation of immune status is a positive and effective green therapy.

Acupoint catgut embedding; Autoimmune uveitis; Experiment; Rat; Aqueous protein

1. 廣西衛(wèi)生自籌計劃課題(Z20170279)2. 2017廣西中醫(yī)藥大學校級面上項目(2017MS029) 3. 國家自然科學基金(81360558)；4. 廣西自然科學基金項目(2010GXNSFA013208)；5. 廣西自然科學基金項目(0342042)；6. 廣西科技攻關計劃項目(12300020)7. 廣西高校科學技術研究項目(KY2015YB157)8.山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(編號：2013ZDZK-083)

1.530023,廣西南寧,廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院；2.312300,浙江紹興,紹興市上虞中醫(yī)醫(yī)院；3.523902,廣東東莞,東莞市虎門中醫(yī)院；4.530001,廣西南寧,廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院；5.,250002,山東濟南,山東中醫(yī)藥大學眼科研究所

郝小波，E-mail：562695922@qq.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.003

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