洪嘉鵬，岳春，趙曉琴，Marie Rose Mukasekuru ，李祥，孫付保*,孫海彥

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(南陽(yáng)理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng)，473004)3(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？冢?71101)

常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣的濃醪酶解

洪嘉鵬1，岳春2，趙曉琴1，Marie Rose Mukasekuru1，李祥1，孫付保1*,孫海彥3

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(南陽(yáng)理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng)，473004)3(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？冢?71101)

為了實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素濃醪酶解在低酶載量時(shí)的“三高”(高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高轉(zhuǎn)化效率)，通過利用常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣為底物，篩選合適的基質(zhì)質(zhì)量濃度(150 g/L)、纖維素酶添加量(6 FPU/g基質(zhì))和添加劑(吐溫80, 30 mg/g基質(zhì))。接著采用分批補(bǔ)料策略使基質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到350 g/L，考察了不同加酶方式對(duì)分批補(bǔ)料濃醪酶解的影響。酶解72 h酶解液葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到132 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到了理論值的60%。結(jié)果表明，常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理基質(zhì)具有較好的可酶解性，添加吐溫80可以顯著提高酶解效率。常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣的分批補(bǔ)料濃醪酶解推動(dòng)了纖維素乙醇濃醪發(fā)酵工業(yè)化進(jìn)程。

常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理;甘蔗渣;濃醪酶解;分批補(bǔ)料;表面活性劑

目前，纖維素乙醇的生產(chǎn)技術(shù)路線已經(jīng)打通，但是過高的生產(chǎn)成本嚴(yán)重阻礙了商業(yè)化進(jìn)程。WINGREN等人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基質(zhì)質(zhì)量濃度從50 g/L提高到80 g/L時(shí)，相應(yīng)的操作成本會(huì)降低19%。而當(dāng)基質(zhì)質(zhì)量濃度從200 g/L上升到300 g/L時(shí)，燃料乙醇的成本能降低0.10美元/加侖[1-2]。高基質(zhì)濃度(濃醪)酶解工藝相比于低基質(zhì)濃度酶解工藝，其在經(jīng)濟(jì)效益方面的優(yōu)勢(shì)非常巨大，主要體現(xiàn)在：(1)由于反應(yīng)體系體積的減小而導(dǎo)致的設(shè)備成本降低；(2)由于加熱和冷卻所需能耗的降低而減少了操作成本；(3)更高的產(chǎn)物濃度意味著下游工藝的成本會(huì)被降低；(4)用水量的減少導(dǎo)致了后期廢棄物處理的成本降低[3]?？梢?，利用纖維素生物質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇的一個(gè)挑戰(zhàn)在于如何實(shí)現(xiàn)高基質(zhì)濃度的纖維素水解產(chǎn)糖的過程。

另外，纖維素酶成本對(duì)纖維素燃料乙醇生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性的影響很大，低纖維素酶添加量能夠幫助降低整個(gè)行業(yè)的生產(chǎn)成本(0.5～1.5美元/加侖)[2, 4-5]。文獻(xiàn)報(bào)道，通常堿催化預(yù)處理后基質(zhì)酶解的加酶量為20 FPU/g纖維素，酸催化預(yù)處理基質(zhì)的加酶量為100 FPU/g纖維素，堿催化后的基質(zhì)所需的加酶量明顯低于酸催化后的基質(zhì)[6]?？傊绾螌?shí)現(xiàn)低酶載量時(shí)基質(zhì)高效水解是另外一個(gè)值得關(guān)注的方向。

截至目前，已有不少關(guān)于木質(zhì)纖維素基質(zhì)濃醪水解的研究報(bào)道。BARYAN等人在180g/L的基質(zhì)質(zhì)量濃度，加酶量20 mg/g(分別為10 mg CTec3和HTec3)葡聚糖的條件下酶解72 h，葡萄糖產(chǎn)率為68%，木糖產(chǎn)率為65%[7]。DAVID等人在加酶量為10.7 FPU/g纖維素的條件下通過分批補(bǔ)料的方式使基質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到333 g/L，240 h的水解液中的葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到了將近140 g/L[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期開展了汽爆-堿性過氧化氫預(yù)處理玉米秸濃醪酶解的研究，劉健權(quán)等人[8]在加酶量為30 FPU/g基質(zhì)的條件下，以156 g/L為起始基質(zhì)質(zhì)量濃度，在酶解12 h時(shí)補(bǔ)加相當(dāng)于200 g/L初始基質(zhì)濃度的干物料以及相應(yīng)量酶液后繼續(xù)酶解24 h，此時(shí)酶解液中的糖質(zhì)量濃度達(dá)到了142 g/L，纖維素轉(zhuǎn)化率接近60%。盡管這些研究結(jié)果在酶解條件(酶載量、酶解時(shí)間或基質(zhì)質(zhì)量濃度)和酶解水平(產(chǎn)糖量、酶解率和酶解效率)的某一個(gè)指標(biāo)方面取得明顯進(jìn)展，但這些研究在低酶載量時(shí)木質(zhì)纖維素基質(zhì)濃醪水解“三高”水平方面均尚未取得突破。

基于此，本文以常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣為原料，嘗試開展低酶載量下基質(zhì)濃醪水解的實(shí)驗(yàn)。首先對(duì)濃醪酶解時(shí)初始基質(zhì)濃度和酶載量進(jìn)行選擇，接著選擇適用于纖維素酶解的添加劑，最后在選擇分批補(bǔ)料方式的基礎(chǔ)上對(duì)基質(zhì)的分批補(bǔ)料濃醪酶解進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

風(fēng)干甘蔗渣，取自于廣西壯族自治區(qū)，用篩子篩選尺寸為5 mm×1 mm左右的甘蔗渣在105℃下烘干，塑封袋保存?zhèn)溆?，成分如下：纖維素含量為41.41%，半纖維素含量為23.78%，木質(zhì)素含量為20.78%。工業(yè)甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%) 購(gòu)自江蘇揚(yáng)州飛揚(yáng)化工有限公司；纖維素酶CTecⅡ來自諾維信公司饋贈(zèng)，酶活力為141 FPU/g。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，日本HITACHI公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；HYG-A全溫?fù)u瓶柜，江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甘蔗渣的常壓甘油堿催化有機(jī)溶劑預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取10 g甘蔗渣，放入500 mL三孔燒瓶?jī)?nèi)，添加140 g工業(yè)甘油和0.3 g NaOH后機(jī)械攪拌混勻，NaOH添加量為2 g/L，對(duì)應(yīng)pH大約為8.2(精密pH試紙測(cè)定),并于加熱套內(nèi)加熱升溫，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，升溫至240 ℃后保溫蒸煮10 min，蒸煮結(jié)束后冷卻約15 min降至150 ℃以下，然后緩慢加入150 g沸水，快速攪拌使纖維充分解離，趁熱用G1砂芯漏斗過濾，用400 g常溫自來水分2次洗滌過濾后，即獲得常壓甘油堿催化有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣纖維。主要組成為：57.69%纖維素、28.65%半纖維素、10.74%木質(zhì)素。

1.3.2 酶解

酶解在100 mL搖瓶中進(jìn)行，按不同基質(zhì)濃度稱取相應(yīng)質(zhì)量的常壓甘油堿催化有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣，按不同的加酶量添加所需的纖維素酶，最后加入適量的pH 4.8檸檬酸緩沖液，使反應(yīng)體系中液體的體積為25 mL。將搖瓶放置于50 ℃，180 r/min的全溫?fù)u瓶柜中酶解，分別在12、24、36、48、72、96 h取樣測(cè)定。

1.3.3 分析測(cè)定

甘蔗渣原料和常壓甘油堿催化有機(jī)溶劑預(yù)處理物料的3大組分含量均采用美國(guó)能源實(shí)驗(yàn)室(National Renewable Energy Laboratory)NREL法測(cè)定[9]；濾紙酶活力(FPA)按照國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)推薦的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定[10]；組分含量測(cè)定中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖濃度采用高效液相(HPLC)法檢測(cè)，色譜柱采用BioRadAminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm)，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫60 ℃，示差檢測(cè)器[11]。酶解過程中還原糖的測(cè)定方法采用3, 5-二硝基水楊酸法[12]，葡萄糖含量測(cè)定采用SBA-40E生物傳感分析儀法。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)1次，數(shù)據(jù)為2次及以上的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 基質(zhì)酶解加酶量的選擇

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣在20 g/L的基質(zhì)質(zhì)量濃度，加酶量為5 FPU/g基質(zhì)時(shí)，48 h酶解率達(dá)到了90%以上，表明了常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理后基質(zhì)具有較好的可酶解性[13-14]。為了探究該纖維素基質(zhì)在高基質(zhì)濃度條件下的可酶解性，本論文首先在100 g/L基質(zhì)質(zhì)量濃度下考察了5種不同加酶量(3、6、10、13、15 FPU/g基質(zhì))對(duì)酶解過程中的還原糖酶解率的影響，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 濃醪酶解(100 g/L基質(zhì)質(zhì)量濃度)加酶量的選擇Fig.1 Selection of the enzyme loading to substrates at 100 g/L solid content

從圖1可以看出，在酶解前24 h，還原糖的酶解率與加酶量呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，酶解率隨著加酶量的增加而提高，酶解24 h后，除加酶量為3 FPU/g基質(zhì)的酶解體系外，其余4種加酶量酶解體系的液化效果均達(dá)到了一個(gè)較高水平，此時(shí)，所有固體基質(zhì)全部液化，整個(gè)酶解體系的傳質(zhì)傳熱效果較好。這一結(jié)果表明，常壓堿催化甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣基質(zhì)具有較好的可酶解性，分析認(rèn)為預(yù)處理對(duì)原料木質(zhì)素的有效脫除應(yīng)該是其重要原因[15]?？紤]到堿預(yù)處理對(duì)纖維質(zhì)木質(zhì)素選擇性脫除效果較好[16]，筆者基于課題組已有的常壓甘油自催化有機(jī)溶劑預(yù)處理嘗試建立堿催化的常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理(詳細(xì)信息將另文報(bào)道)，發(fā)現(xiàn)堿催化的預(yù)處理更能有效溶解脫出甘蔗渣木質(zhì)素(75%)，比自催化預(yù)處木質(zhì)素脫除(65%)提高15%以上。

在加酶量為6 FPU/g基質(zhì)時(shí)，堿催化預(yù)處理基質(zhì)的48 h酶解率為80.65%，酶載量為15 FPU/g基質(zhì)所對(duì)應(yīng)的酶解率為87.34%。結(jié)果表明，基質(zhì)酶載量為6 FPU/g基質(zhì)已達(dá)到了較高酶解率，與其他高酶載量相比，高的酶載量已不能有效提高酶解率。鑒于纖維素酶成本和采用低酶載量的考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇酶載量為6 FPU/g基質(zhì)。

2.2 濃醪酶解初始基質(zhì)濃度的選擇

在低纖維素酶酶載量條件下實(shí)現(xiàn)高基質(zhì)濃度的酶解轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化的必要途徑[3]。鑒于此，本論文在纖維素酶添加量為6 FPU/g基質(zhì)的條件下考察了100、120、150、180和200 g/L基質(zhì)質(zhì)量濃度時(shí)酶解情況。結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同基質(zhì)質(zhì)量濃度下48 h的酶解率Fig.2 Enzymatic hydrolysis of substrates at different solid content for 48 h

酶解48 h時(shí)基質(zhì)100 g/L質(zhì)量濃度的酶解率為80.6%，而120 g/L和150 g/L基質(zhì)濃度條件下所對(duì)應(yīng)的酶解率略有降低，分別為78.8%和76.8%；180 g/L和200 g/L基質(zhì)質(zhì)量濃度所對(duì)應(yīng)的酶解率明顯降低，在72%左右?？梢姡|(zhì)酶解率與基質(zhì)濃度呈負(fù)相關(guān)，隨著基質(zhì)濃度增加，基質(zhì)酶解率明顯下降，這一現(xiàn)象與其他科研工作者的報(bào)道相符[8, 17]。在酶解率相同時(shí)，基質(zhì)濃度越高，意味著基質(zhì)酶解所產(chǎn)糖濃度越高，這對(duì)提高纖維素乙醇工業(yè)的生產(chǎn)效率具有重大的意義。因此，本研究選擇在150 g/L基質(zhì)濃度條件下進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同酶解添加劑對(duì)酶解過程的影響

有文獻(xiàn)報(bào)道[6, 18-19]，在酶解過程中添加一定量的表面活性劑可以有效減少酶解過程的酶用量及增加糖得率。前期研究發(fā)現(xiàn)，在底物濃度為0.05g/g底物條件下添加2種非離子表面活性劑吐溫80和PEG 6000后，葡萄糖產(chǎn)量分別提高20%；席琳喬等發(fā)現(xiàn)，添加3.0 g/L的PEG 6000能顯著提高棉稈木質(zhì)纖維素的酶解效率[20]。鑒于此，本論文在150 g/L基質(zhì)質(zhì)量濃度和加酶量6 FPU/g基質(zhì)的條件下考察生物素、赤霉素、聚丙烯酰胺、吐溫80和PEG 4000五種添加劑對(duì)酶解過程的影響。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期工作及文獻(xiàn)報(bào)道[8, 11, 18-19, 21-22]，選擇生物素、赤霉素、聚丙烯酰胺、吐溫80和PEG 4000的添加量分別為75、10、0.05、50和10 mg/g基質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同添加劑對(duì)酶解產(chǎn)糖的影響Fig.3 Effect of different additives on the glucose yield from enzymatic hydrolysis of substrates

從圖3可以發(fā)現(xiàn)，添加吐溫80和PEG 4000對(duì)酶解產(chǎn)糖過程起到了明顯的促進(jìn)作用。酶解24 h，添加50 mg/g基質(zhì)的吐溫80所對(duì)應(yīng)葡萄糖產(chǎn)量為63 g/L，添加10 mg/g基質(zhì)的PEG 4000所對(duì)應(yīng)葡萄糖產(chǎn)量為61 g/L，相比空白對(duì)照樣品分別提高了10%和7%。同樣，48 h時(shí)吐溫80的添加使得葡萄糖產(chǎn)量提高14%，PEG 4000使得葡萄糖產(chǎn)量提高7%。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明，在酶解過程中添加吐溫80和PEG 4000能明顯促進(jìn)纖維素酶酶解，但不同種類的表面活性劑促進(jìn)效果是可能有差異的。鑒于此，表面活性劑吐溫80和PEG 4000被選擇用于后續(xù)基質(zhì)濃醪酶解。

圖4 PEG 4000和吐溫80不同添加量對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.4 Effect of the respective dose of PEG 4000 and Tween 80 on the glucose yield from enzymatic hydrolysis of substrates

表面活性劑適宜添加量實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可以得出，不同濃度的2種添加劑均對(duì)酶解產(chǎn)糖過程起到了一定的促進(jìn)作用。當(dāng)PEG 4 000添加量為20 mg/g基質(zhì)時(shí)其對(duì)產(chǎn)糖的促進(jìn)作用最明顯，24 h產(chǎn)糖達(dá)到了57 g/L，跟空白對(duì)照相比提高了9%；當(dāng)吐溫80添加量為30 mg/g基質(zhì)時(shí)，24 h酶解率提高已達(dá)最高水平，產(chǎn)糖為59 g/L，比空白對(duì)照提高了12%。2種表面活性劑相比，添加吐溫80更能促進(jìn)基質(zhì)的酶解產(chǎn)糖。這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似[21, 23-24]。解釋添加非離子表面活性劑有利于提高纖維素原料酶解最經(jīng)典的理論為木質(zhì)素能夠無效吸附纖維素酶的理論。ERICSSON認(rèn)為，木質(zhì)纖維素降解過程中，木質(zhì)素上的大量疏水集團(tuán)能夠與纖維素酶上分子的碳鏈發(fā)生疏水相互作用，對(duì)其進(jìn)行吸附，降低酶解過程中的有效酶量，阻礙纖維素的酶解。添加表面活性劑后，部分表面活性劑可與纖維素酶發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，并部分吸附到木質(zhì)素表面，從而減少了纖維素酶在木質(zhì)素表面的無效吸附，最終使整個(gè)過程所需的酶負(fù)荷量減小，進(jìn)而提高纖維素原料的酶解率[18, 25]。WILLIAM等人研究發(fā)現(xiàn)[22]，當(dāng)添加0.15 g/g干基質(zhì)的吐溫80時(shí)纖維素72 h酶解率提高36%，半纖維素酶解率提高18%。吐溫80在整個(gè)酶解過程的作用主要有3點(diǎn)：纖維素酶穩(wěn)定劑、木質(zhì)素破壞劑以及纖維素酶效應(yīng)物。綜上所述，添加吐溫80能夠促進(jìn)纖維素酶酶解，這有利于高濃度纖維素基質(zhì)在低纖維素酶添加量時(shí)實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化效率。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇添加30 mg/g基質(zhì)的吐溫80，以促進(jìn)基質(zhì)酶解產(chǎn)糖。

2.4 分批補(bǔ)料濃醪酶解的加酶方式選擇

前面基質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)證明了常壓堿性甘油預(yù)處理甘蔗渣基質(zhì)具有很好的可酶解性，在酶載量6 FPU/g基質(zhì)條件下150 g/L濃度基質(zhì)的48 h酶解率達(dá)到了80%。鑒于過高基質(zhì)濃度的黏度和流體力學(xué)問題，本論文采用了分批補(bǔ)料方式進(jìn)一步提高酶解時(shí)的基質(zhì)濃度[1, 26-27]。實(shí)驗(yàn)中選擇酶解的初始基質(zhì)質(zhì)量濃度為150 g/L，加酶量6 FPU/g基質(zhì)，在酶解起始12、18、24、30 h分別補(bǔ)加提高50 g/L基質(zhì)濃度的基質(zhì)，從而使得酶解30 h時(shí)基質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到350 g/L，在該條件下考察不同加酶方式對(duì)產(chǎn)糖的影響。加酶方式1#是在酶解起始時(shí)一次性加入350 g/L基質(zhì)濃度對(duì)應(yīng)的所有纖維素酶，后面補(bǔ)料時(shí)只補(bǔ)加基質(zhì)；加酶方式2#選擇在酶解起始時(shí)一次性加入所需纖維素酶總量的2/3，補(bǔ)加基質(zhì)時(shí)再平均補(bǔ)加剩余的1/3的纖維素酶量。

結(jié)果如圖5所示，加酶方式1#，48 h時(shí)葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到106 g/L，96 h時(shí)達(dá)到了128 g/L。加酶方式2#，在對(duì)應(yīng)酶解時(shí)間點(diǎn)的葡萄糖質(zhì)量濃度分別為88 g/L和116 g/L。實(shí)驗(yàn)表明，在酶解前期一次性添加所有纖維素酶有利于整個(gè)分批補(bǔ)料酶解過程的產(chǎn)糖，其葡萄糖產(chǎn)量在整個(gè)酶解過程中均明顯高于加酶方式2#，加酶方式1#更加有利于分批補(bǔ)料濃醪酶解過程中葡萄糖的生成。該結(jié)果似乎與OLOFSSON等人報(bào)道相矛盾，他們?cè)诶脴?gòu)建的數(shù)學(xué)模型研究加酶方式對(duì)SSCF過程中糖的轉(zhuǎn)化效率時(shí)發(fā)現(xiàn)，分批補(bǔ)加纖維素酶有利于糖的轉(zhuǎn)化，其原因在于糖的積累會(huì)對(duì)纖維素酶造成反饋抑制[28]。不過，本文結(jié)果與WANG和GAO等的研究結(jié)果一致[29-30]，酶解起始時(shí)加入所有的纖維素酶能夠使基質(zhì)迅速液化，快速減小酶解液的黏度，當(dāng)后續(xù)補(bǔ)加物料時(shí)體系里傳質(zhì)傳熱均達(dá)到了一個(gè)比較理想的水平。兩種觀點(diǎn)不一致的原因可能在于：本實(shí)驗(yàn)中基質(zhì)酶載量相對(duì)較低，一次性加酶在促使基質(zhì)快速液化和減小黏度的同時(shí)并沒有產(chǎn)生大量葡萄糖以反饋抑制纖維素酶；另外，不同種類纖維素酶對(duì)糖反饋抑制的耐受性不同而導(dǎo)致的，本實(shí)驗(yàn)中所用的Cellic CTec2酶制劑屬于諾維信新一代纖維素酶產(chǎn)品，適用于高濃度基質(zhì)的酶解發(fā)酵，糖濃度耐受性更好。鑒于此，選擇加酶方式1#開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 分批補(bǔ)料不同加酶方式對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.5 Effects of the enzyme feeding mode on enzymatic hydrolysis of substrates

2.5 分批補(bǔ)料基質(zhì)濃醪酶解產(chǎn)糖

本實(shí)驗(yàn)選擇初始基質(zhì)質(zhì)量濃度為15 g/L，纖維素酶添加量為6 FPU/g基質(zhì)，吐溫80添加量為30 mg/g基質(zhì)，考察分批補(bǔ)料至350 g/L基質(zhì)濃度的濃醪酶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。在酶解前30 h，添加吐溫80與否的基質(zhì)酶解趨勢(shì)差不多一致，酶解30 h酶解液中葡萄糖質(zhì)量濃度都在90 g/L左右，此時(shí)吐溫80添加對(duì)酶解產(chǎn)糖未起到明顯促進(jìn)作用。但酶解開始30 h后添加表面活性劑的分批補(bǔ)料濃醪酶解產(chǎn)糖快速提高，72 h基本完成酶解，水解產(chǎn)量基本達(dá)到最高水平132 g/L，達(dá)到理論產(chǎn)糖量的60%；未添加表面活性劑的分批補(bǔ)料酶解產(chǎn)糖過程相對(duì)緩慢，72 h產(chǎn)糖110 g/L，96 h產(chǎn)糖120 g/L。分析認(rèn)為[22-23]，酶解初始時(shí)纖維素酶含量較高，相當(dāng)于14 FPU/g基質(zhì)，木質(zhì)纖維素基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)主要被纖維素酶占據(jù)，所以吐溫80作用不明顯；酶解30 h后完成了分批補(bǔ)料，此時(shí)醪液中基質(zhì)濃度是350 g/L，纖維素酶濃度顯著降低(理論上為6 FPU/g基質(zhì))，此時(shí)基質(zhì)的一些結(jié)合位點(diǎn)被吐溫80占據(jù)，所以吐溫80此時(shí)起發(fā)揮有效作用。

不少研究者采取分批補(bǔ)料策略探討高濃度基質(zhì)的濃醪酶解，如表1所示。龔信芳等人[31]采用以40 g/L為起始底物濃度，每隔12 h進(jìn)行補(bǔ)料對(duì)木薯渣進(jìn)行分批補(bǔ)料酶解，使得最終底物濃度為160 g/L，72 h水解液中葡萄糖濃度為65.7 g/L。GAO等[30]以120g/L基質(zhì)濃度為起始基質(zhì)濃度，分別在6、12和24 h補(bǔ)加7%基質(zhì)，從而使得最終基質(zhì)濃度達(dá)到了330 g/L，加酶量10 FPU/g基質(zhì)，酶解120 h的葡萄糖濃度達(dá)到了129.50 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到了理論值的60%。WANG等[32]在加酶量20 FPU/g纖維素和添加一定量吐溫80條件下，以150 g/L基質(zhì)濃度作為初始基質(zhì)濃度，在酶解24 h和30 h分別補(bǔ)加50 g/L和100 g/L基質(zhì)，使得最終基質(zhì)濃度達(dá)到300 g/L，72 h葡萄糖產(chǎn)量為88.95 g/L。

圖6 基質(zhì)的分批補(bǔ)料濃醪酶解Fig.6 Fed-batch thick-mash enzymatic hydrolysis of substrates

表1 不同分批補(bǔ)料酶解結(jié)果的對(duì)比Table 1 Comparison of various fed-batch thick-mash enzymatic hydrolysis of substrates

相比上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文開展的木質(zhì)纖維素基質(zhì)濃醪酶解結(jié)果是比較理想的，在實(shí)現(xiàn)濃醪酶解 “三高”(高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高轉(zhuǎn)化效率)特點(diǎn)方面有明顯進(jìn)展。課題組早期曾評(píng)估過常壓甘油自催化有機(jī)溶劑預(yù)基質(zhì)的可酶解性，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后麥草具有較好的可酶解性，但該評(píng)估是在低基質(zhì)濃度(20 g/L，加酶量5 FPU/g基質(zhì))條件下進(jìn)行的，缺乏工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[33]。在此基礎(chǔ)上，本文以常壓堿性甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理甘蔗渣為原料，探討預(yù)處理后基質(zhì)濃醪酶解(基質(zhì)濃度350 g/L, 6 FPU/g基質(zhì))的可行性。

3 結(jié)論

本論文通過考察不同的加酶方式和不同的添加劑對(duì)酶解產(chǎn)糖的影響，利用分批補(bǔ)料酶解手段，使得常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理基質(zhì)在350 g/L質(zhì)量濃度時(shí)酶解72 h，葡萄糖質(zhì)量濃度為132 g/L，酶解率60%。常壓甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理基質(zhì)在濃醪方面具有很強(qiáng)的可酶解性，實(shí)現(xiàn)了在低加酶量條件下的濃醪酶解產(chǎn)糖，這為下一步繼續(xù)開展低酶載量下濃醪基質(zhì)的“三高”酶解和纖維素乙醇發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。

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Thick-mashenzymatichydrolysisofatmosphericglycerolorganosolvpretreatedsugarcanebagasse

HONG Jia-peng1, YUE Chun2, ZHAO Xiao-qin1, Marie Rose Mukasekuru1,LI-Xiang1, SUN Fu-bao1*, SUN Hai-yan3

1 (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2 (School of Biotechnology, Nanyang University of Technology,Nanyang 473004, China)3 (Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101, China)

In order to reach the "THREE-HIGH" (High-titer, High-productivity and High-conversion) technical levels of enzymatic hydrolysisat low cellulase loading, the enzymatic hydrolysis at high solid concentration was conducted. The enzymatic hydrolysis conditions were optimized enzyme loading 6 FPU/g substrate, substrate concentration 150 g/L) and the suitable additive (Tween 80 30 mg/g substrate. Further, a fed-batch strategy was adopted to make the final solid concentration up to 35%, followed by detecting a reasonable cellulase addition way.Finally, the final glucose yield achieved 132 g/L at 72 h from the fed-batch thick-mash enzymatic hydrolysis, with 60% of the cellulose conversion.Results indicate that the atmospheric alkali-catalyzed glycerol pretreated substrate very applicable and attractive for the thick-mash enzymatic hydrolysis at a low cellulase loading. The feedbatcha preferable way to realize "THREE-HIGH" technological level of thick-mash enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass.

atmospheric glycerol organosolv pretreatment; sugarcane bagasse; thick-mash enzymatic hydrolysis; fed-batch; surfactant

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014387

碩士研究生(孫付保為通訊作者,E-mail: fubaosun@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21176106)：中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015M571666;2016T90419)；江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助課題(JSBGFC14006)；河南省科技開放合作項(xiàng)目(162106000007)

2017-03-21，改回日期：2017-04-27