盧琴，李杰

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430015；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

·中藥工業(yè)·

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定楓蓼腸胃康膠囊中4種黃酮苷成分的含量

盧琴1*，李杰2

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430015；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

目的建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定楓蓼腸胃康膠囊中蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量的方法。方法采用Waters X bridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷的質(zhì)量濃度分別在12.42～310.50、5.95～148.75、6.85～171.25、7.88～197.00 μg·mL與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率分別為98.6%、104.2%、104.5%、101.0%(n=6)，RSD分別為1.3%、1.1%、1.3%、1.6%。結(jié)論本方法符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，簡(jiǎn)便、快捷，可用于楓蓼腸胃康膠囊中4種黃酮苷成分的同時(shí)測(cè)定。

楓蓼腸胃康膠囊；蘆丁；金絲桃苷；槲皮苷；山奈酚-3-O-蕓香糖苷

楓蓼腸胃康膠囊是由牛耳楓、辣蓼2味藥組方加工制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱、除濕、化滯的功能，用于急性胃腸炎屬于傷食泄瀉型及濕熱泄瀉型者，癥見腹痛腹?jié)M、泄瀉臭穢、惡心嘔腐或有發(fā)熱惡寒、苔黃、脈數(shù)等疾病，亦可用于食滯胃痛而癥見胃脘痛、拒按、惡食欲吐、噯腐吐酸、舌苔厚膩或黃膩脈數(shù)者[1]。牛耳楓為虎皮楠科虎皮楠屬植物牛耳楓DaphniphyllcalycinumBenth.的干燥帶葉莖枝，具有清熱解毒、止痛消腫、祛風(fēng)活血的功能。牛耳楓是海南省優(yōu)勢(shì)黎藥品牌產(chǎn)品楓蓼腸胃康制劑的君藥，主要含有蘆丁、木犀草素、槲皮苷、Yuzurimine、DaPhnane、Secodaphnane等黃酮類及生物堿類成分[2-5]。辣蓼為蓼科植物伏毛蓼PolygonumpubescensBlume的干燥全草，具有祛風(fēng)利濕、消腫解毒、散淤止痛、止癢殺蟲等功能，主要含金絲桃苷、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-蕓香苷等黃酮類成分[6-8]。楓蓼腸胃康膠囊制劑工藝中，牛耳楓和辣蓼一起加水煎煮，牛耳楓和辣蓼中的黃酮類特別是黃酮苷類成分容易被煎提出來[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，楓蓼腸胃康膠囊中蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷等4種黃酮苷類成分含量較高，因此，本研究選擇上述4種黃酮苷類成分作為指標(biāo)成分，建立楓蓼腸胃康膠囊的質(zhì)量控制方法。楓蓼腸胃康制劑現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中以蘆丁為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，查閱文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)有測(cè)定楓蓼腸胃康片中山奈酚-3-O-蕓香苷、沒食子酸的含量的報(bào)道[11]，而采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)同時(shí)測(cè)定楓蓼腸胃康制劑中4種黃酮苷類成分的含量未見報(bào)道。本研究采用RP-HPLC同時(shí)測(cè)定楓蓼腸胃康膠囊中蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷4種黃酮苷類成分的含量，并兼顧牛耳楓和辣蓼2味藥的成分，為制定楓蓼腸胃康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Series高效液相儀(包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測(cè)器)；SB3200-T型數(shù)控超聲儀(功率：500 W，頻率：40 KHz，上海必能信超聲有限公司)；AE240型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅牡勒公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100080-200707、111521-201406、111538-200905，純度>98.0%)；山奈酚-3-O-蕓香糖苷(批號(hào)：W0040010，純度>98.0%，天津一方科技有限公司)。

楓蓼腸胃康膠囊購(gòu)自于藥店(批號(hào)分別為Z10980060、Z10980061、Z10980062、Z10980063、Z10980064，規(guī)格：0.37 g×12粒，?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?；牛耳楓(批號(hào)：20150804)及辣蓼(批號(hào) 20151026)藥材購(gòu)于廣東大翔藥業(yè)有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定，分別為虎皮楠科虎皮楠屬植物牛耳楓DaphniphyllcalycinumBenth.的干燥帶葉莖枝和蓼科植物伏毛蓼PolygonumpubescensBlume的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取上述各對(duì)照品適量，加入50%乙醇制成含蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷分別為2.484、2.380、2.740、1.576 mg·mL-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別取單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置于10 mL容量瓶中，配制成含蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷分別為1.242、0.595、0.685、0.788 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，配制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取楓蓼腸胃康膠囊10粒，除去膠囊殼，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%乙醇20 mL，超聲(500 W，40 KHz)提取30 min，提取2次，濾過，合并濾液定容到50 mL，過0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照品溶液 按楓蓼腸胃康膠囊的處方工藝分別制備缺牛耳楓和辣蓼的陰性樣品，再制備陰性供試品溶液，即得。

2.2 色譜條件

用Waters X bridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%→15%A；10～25 min，15%→20%A；25～40 min，20%→35%A)；體積流量：1.0 mL·min-1；控制柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm；進(jìn)樣量為10 μL，色譜圖見圖1。

2.3 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下系列濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣分析，記錄各色譜峰面積。以進(jìn)樣濃度(X，μg·mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷等4種黃酮苷成分的線性范圍、回歸方程見表1；以信噪比(S/N)為3∶1和10∶1為基準(zhǔn)測(cè)得各化合物的檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表1。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述4種黃酮苷成分的混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD分別為1.1%、1.2%、0.79%、0.93%(n=6)。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批楓蓼腸胃康膠囊(批號(hào)：Z10980060)6份，按2.1.2方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積值并計(jì)算各成分含量，結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷的平均含量分別為0.51、0.33、0.26、0.80 mg/粒，RSD分別為1.6%、1.3%、0.97%、1.9%，表明本方法重復(fù)性良好。

注：A.混合對(duì)照品；B.楓蓼腸胃康膠囊樣品；C.缺辣蓼陰性樣品；D.缺牛耳楓陰性樣品；1.蘆丁；2.金絲桃苷；3.槲皮苷；4.山奈酚-3-O-蕓香糖苷。圖1 對(duì)照品與樣品HPLC色譜圖

成分線性方程r線性范圍/μg·mL檢測(cè)限/ng定量限/ng蘆丁Y=21×103X-3296099991242～31050102093金絲桃苷Y=20×103X+1153709999595～14875130054槲皮苷Y=27×103X+897309999685～17125204107山奈酚?3?O?蕓香糖Y=21×103X+901109999788～19700113082

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品(批號(hào)：Z10980060)溶液，分別在樣品制備后0～24 h，每間隔4 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD分別為0.87%、1.6%、1.9%、1.2%，表明樣品中上述4種黃酮苷成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取楓蓼腸胃康膠囊(批號(hào)：Z10980060)粉未6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置具塞三角錐瓶中，精密加入2.1.1項(xiàng)的蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按2.1.2項(xiàng)的方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，計(jì)算各成分的回收率，結(jié)果詳見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2(續(xù))

2.4 樣品測(cè)定

取5批楓蓼腸胃康膠囊樣品，按2.1.2項(xiàng)的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，計(jì)算含量，結(jié)果詳見表3。

表3 楓蓼腸胃康膠囊中4種黃酮苷成分的含量(n=3) mg/粒

3 討論

3.1 提取方法的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了不同濃度的乙醇(30%、50%、70%、80%、100%)對(duì)4種黃酮苷成分提取率的影響。結(jié)果顯示，采用50%乙醇為提取溶劑，4種黃酮苷成分提取率高且雜質(zhì)干擾小。對(duì)超聲處理時(shí)間、溶媒用量和提取次數(shù)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)用40倍量的50%乙醇超聲處理30 min，提取2次即可保證4種活性成分被提取完全。因此，選擇50%乙醇為提取溶劑，超聲提取2次，每次30 min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器對(duì)4種黃酮苷成分進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)為255、359 nm，金絲桃苷的最大吸收波長(zhǎng)為256、354 nm，槲皮苷的最大吸收波長(zhǎng)為256、350 nm，山奈酚-3-O-蕓香糖苷的最大吸收峰為265、346 nm，綜合考濾，分別考察了255、350 nm波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)350 nm波長(zhǎng)處4種黃酮苷成分的響應(yīng)相對(duì)較高且雜質(zhì)峰干擾較少，各組分分離度較好，故選擇350 nm為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?批楓蓼腸胃康膠囊中蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷4種黃酮苷成分的含量，各批次樣品均能檢測(cè)出上述4種黃酮苷類成分。但不同批次間蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷的含量有一定差異，可能與牛耳楓、辣蓼原料藥材的產(chǎn)地及采收加工有關(guān)，因此有必要對(duì)楓蓼腸胃康膠囊各有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制，使制劑均一穩(wěn)定，從而保證其安全有效性，該方法的建立為楓蓼腸胃康膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

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SimultaneousDeterminationofFourFlavonoidGlycosidesinFengliaoChangweikangJiaonangbyRP-HPLC

LU Qing1*，LI Jie2

(1.HubeiprovincialHospitalofIntegratedChinese&WesternMedicine,Hubei430015,China; 2.HubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430065,China)

Objective: To establish an RP-HPLC method for simultaneous determination of rutin, hyperoside, quercetin-3-rhamnoside and kaempferol-3-O-rutinoside in Fengliao Changweikang Jiaonang.MethodsThe Waters X bridge C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)column was adopted; the mobile phase was methanol (A)-0.2% formic acid (B) with gradient elution, flow rate was 1.0 mL·min-1, column temperature was 25 ℃, and detection wavelength was 270 nm.ResultsThe concentration range of the four kinds of glycosides were in 12.42-310.50、5.95-148.75、6.85-171.25 and 7.88-197.00 μg·mL, respectively, and recoveries (n=6) were 98.6%、104.2%、104.5%、101.0%, respectively, RSD were 1.3%、1.1%、1.3% and 1.6%, respectively.ConclusionThe established RP-HPLC method was simple and fast, which can be used for four flavonoid glycosides of Fengliao Changweikang Jiaonang.

Fengliao Changweikang Jiaonang; rutin; hyperoside; quercetin-3-rhamnoside; kaempferol-3-O-rutinoside

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.020

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盧琴，副主任藥師，研究方向：中藥質(zhì)量研究；E-mail：luqing20150601@163.com

2016-11-28)