盛曉靜，周鶴，賴杰仁

(1.九江市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 九江 332000；2.九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000)

·中藥工業(yè)·

補(bǔ)腎蠲毒丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

盛曉靜1*，周鶴1，賴杰仁2

(1.九江市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 九江 332000；2.九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000)

目的建立補(bǔ)腎蠲毒丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法采用顯微鑒別法對(duì)山藥、苦參、僵蠶、郁金進(jìn)行定性鑒別，采用薄層色譜法對(duì)菟絲子、虎杖、黃芩、赤芍進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)測(cè)定黃芪甲苷的含量。結(jié)果本品顯微鑒別特征明顯，薄層色譜定性鑒別斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)；含量測(cè)定方法中，黃芪甲苷的量在0.252 0～3.150 0 μg呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，平均回收率為99.80%。結(jié)論所建立的方法準(zhǔn)確可靠、易于操作，可用于補(bǔ)腎蠲毒丸的質(zhì)量控制。

補(bǔ)腎蠲毒丸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；顯微鑒別；薄層色譜法；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法

補(bǔ)腎蠲毒丸是在九江市中醫(yī)醫(yī)院肝病科鄒必英副主任醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上制成的中藥濃縮丸。

制劑處方以菟絲子、枸杞子、巴戟天、肉蓯蓉為君，補(bǔ)腎益精健脾；以虎杖、黃芩、胡黃連、青蒿、苦參為臣，清熱化濕蠲毒；配以黃芪、山藥、生麥芽益氣健脾助運(yùn)，郁金、皂角刺解郁行氣化瘀，赤芍、僵蠶涼血止痛散結(jié)。全方16味補(bǔ)瀉同用，溫涼并施，益陽(yáng)扶正不礙邪、達(dá)蠲邪毒不傷正，具補(bǔ)腎健脾、清化濕熱的功能，臨床用于脾腎陽(yáng)虛兼夾濕熱型慢性乙肝、乙肝病毒攜帶者的治療多年，效果顯著。制成的補(bǔ)腎蠲毒丸除山藥、郁金、苦參、僵蠶以原粉入藥外，其余12味均經(jīng)過(guò)提取濃縮，具有藥效緩和、作用持久、服用方便、利于攜帶等優(yōu)點(diǎn)。為了有效控制制劑質(zhì)量，本研究建立了山藥、苦參、僵蠶、郁金、菟絲子、虎杖、黃芩、赤芍的定性鑒別及黃芪甲苷的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

OLYMPUS CX41三目顯微鏡；Waters高效液相色譜儀(e2695分離模塊、2489檢測(cè)器、empower工作站)；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Sartorius Bp211D 分析天平；YIY-uL 300W -C型超聲波清洗機(jī)機(jī)(上海藝源超聲設(shè)備有限公司)；CAMAG TLC VISUALIZER 薄層色譜成像系統(tǒng)。

1.2 試藥

超純水、色譜乙腈(Honeywell,HPLC Grade)；薄層層析用硅膠G(青島海洋化工廠生產(chǎn)，化學(xué)純)；其他試劑均為分析純；菟絲子對(duì)照藥材、大黃素對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為121232-201403、110756-200110、110715-201318、110736-201438、110781-201314，其中黃芪甲苷對(duì)照品含量以95.8%計(jì))；補(bǔ)腎蠲毒丸(九江市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號(hào)分別為20141001、20141002、20141003、20150101、20150102、20150103、20150104、20150701、20150702、20150703)。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

本品粉末棕褐色。草酸鈣針晶束存在于黏液細(xì)胞中，針晶長(zhǎng)80～240 μm，粗2～5 μm(山藥)；纖維束周圍的細(xì)胞中含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細(xì)胞的壁不均勻木化增厚(苦參)；菌絲體存在于體壁或淡棕色、半透明結(jié)晶塊中，菌絲近無(wú)色，細(xì)長(zhǎng)，直徑1～5 μm，相互盤纏交織(僵蠶)；含糊化淀粉粒的薄壁細(xì)胞單個(gè)散在或數(shù)個(gè)相連(郁金)[1-2]。見(jiàn)圖1。

注：A.草酸鈣針晶束(山藥)；B.晶纖維(苦參)；C.菌絲體(僵蠶)；D.含糊化淀粉粒的薄壁細(xì)胞(郁金)。圖1 補(bǔ)腎蠲毒丸粉末顯微特征圖(10×40倍)

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 菟絲子的鑒別 取補(bǔ)腎蠲毒丸樣品2 g，研細(xì)，加水30 mL，攪勻，用脫脂棉濾過(guò)，濾液置分液漏斗中，加石油醚(30～60 ℃)30 mL，振搖提取，棄去石油醚提取液，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取菟絲子對(duì)照藥材0.5 g，加水30 mL，煎煮30 min，放冷，濾過(guò)，濾液置分液漏斗中，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺菟絲子陰性對(duì)照樣品2 g，與供試品溶液的制備方法同法制得陰性對(duì)照樣品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(10∶1∶2)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾[3]。見(jiàn)圖2。

注：1～3.補(bǔ)腎蠲毒丸樣品；4.菟絲子對(duì)照藥材；5.缺菟絲子的陰性對(duì)照。圖2 補(bǔ)腎蠲毒丸中菟絲子TLC鑒別圖

注：1～3.補(bǔ)腎蠲毒丸樣品；4.大黃素對(duì)照品；5.缺虎杖的陰性對(duì)照。圖3 補(bǔ)腎蠲毒丸中虎杖TLC鑒別圖

2.2.2 虎杖的鑒別 取補(bǔ)腎蠲毒丸樣品5 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸2 mL，水浴加熱30 min，放冷，用乙醚振搖提取3次，每次15 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃素對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺虎杖的陰性對(duì)照樣品5 g，與供試品溶液的制備方法同法制得陰性對(duì)照樣品溶液。吸取上述供試品溶液及陰性對(duì)照樣品溶液各5 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置氨氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾[4]。見(jiàn)圖3。

2.2.3 黃芩的鑒別 取補(bǔ)腎蠲毒丸樣品5 g，研細(xì)，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺黃芩的陰性對(duì)照樣品5 g，與供試品溶液的制備方法同法制得陰性對(duì)照樣品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾[5]。見(jiàn)圖4。

注：1～3.補(bǔ)腎蠲毒丸樣品；4.黃芩苷對(duì)照品；5.缺黃芩的陰性對(duì)照。圖4 補(bǔ)腎蠲毒丸中黃芩TLC鑒別圖

2.2.4 赤芍的鑒別 取補(bǔ)腎蠲毒丸樣品5 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次20 mL，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺赤芍的陰性對(duì)照樣品5 g，與供試品溶液的制備方法同法制得陰性對(duì)照樣品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾[6-7]。見(jiàn)圖5。

注：1～3.補(bǔ)腎蠲毒丸樣品；4.芍藥；苷對(duì)照品；5.缺赤芍的陰性對(duì)照。圖5 補(bǔ)腎蠲毒丸中赤芍TLC鑒別圖

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Thermo SCIENTIFIC HypersiL GOLD(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相為乙腈-水(31∶69V/V)；流速:1.0 mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：霧化器溫度35 ℃；漂移管溫度80 ℃；載氣N2；氣體壓力0.207 MPa。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于7000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.13 mg·mL-1的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇100 mL，加熱回流提取6 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?5 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用濃氨試液洗滌2次，每次25 mL，濃氨試液再用水飽和的正丁醇25 mL提取，合并正丁醇提取液，回收正丁醇至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[8]。

2.3.4 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液10、20 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。

2.3.5 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取按照本品制劑處方及生產(chǎn)工藝要求制備的缺黃芪的陰性樣品，按2.3.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，即得缺黃芪的陰性對(duì)照樣品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照樣品溶液各10 μL進(jìn)行高效液相色譜試驗(yàn)，所得陰性對(duì)照色譜圖中，在補(bǔ)腎蠲毒丸色譜圖中黃芪甲苷的出峰位置上未出現(xiàn)色譜峰，表明處方中其他藥材對(duì)黃芪甲苷的含量測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖6。

2.3.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(0.126 0 mg·mL-1)2、5、10、15、20、25 μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，以黃芪甲苷進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程:Y=1.633X+6.516，r=0.999 6。結(jié)果表明，黃芪甲苷的進(jìn)樣量在0.252 0～3.150 0 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積分別為4 658 951、4 691 602、4 480 464、4 800 282、4 580 005、4 629 281，對(duì)應(yīng)的常用對(duì)數(shù)值分別為6.668、6.671、6.651、6.681、6.661、6.666，RSD為0.16%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、24 h，注入高效液相色譜儀，測(cè)定黃芪甲苷含量，RSD為0.60%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

注：A.黃芪甲苷對(duì)照品；B.樣品；C.陰性對(duì)照品；1.黃芪甲苷。圖6 黃芪甲苷對(duì)照品、樣品及陰性對(duì)照品HPLC圖

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(20150101)6份，按2.3.3項(xiàng)下方法平行操作后，分別測(cè)定黃芪甲苷含量，結(jié)果含量平均值為0.194 5 mg·g-1，RSD為1.39%。結(jié)果表明，在同一條件下，6次測(cè)得樣品黃芪甲苷含量一致。

2.3.10 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知含量的補(bǔ)腎蠲毒丸樣品(20150101)6份，分別精密添加一定量的黃芪甲苷對(duì)照品，按2.3.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，各取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定黃芪甲苷含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)腎蠲毒丸中黃芪甲苷回收率測(cè)定(n=6)

2.3.11 樣品測(cè)定 取10批樣品，按上述色譜條件和方法測(cè)定黃芪甲苷的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批補(bǔ)腎蠲毒丸含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

補(bǔ)腎蠲毒丸處方配伍16味，其中山藥、苦參、僵蠶、郁金4味以藥材原粉入藥，采用顯微鑒別法簡(jiǎn)單易行，可有效定性鑒別。通過(guò)薄層色譜法實(shí)驗(yàn)研究，菟絲子、虎杖、黃芩、赤芍均可采用適宜的提取方法和展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行定性鑒別，且薄層色譜斑點(diǎn)明顯，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

考慮到本品重用黃芪補(bǔ)氣、利水，用量占處方總藥量的14.6%，我們研究了采用高效液相色譜法測(cè)定黃芪甲苷的含量。取黃芪甲苷對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果最大吸收峰在200 nm波長(zhǎng)處屬于末端吸收，故選擇用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)進(jìn)行檢測(cè)。選擇不同品牌的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-水(31∶69)時(shí)，采用Waters SunFireTMC18、Thermo HypersiL GoLd或SHIMADZU-GL WondaCr act ODS-2等色譜柱時(shí)，均能達(dá)到有效分離的目的，且峰形較好，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾。供試品溶液的制備主要包括索氏提取和萃取兩部分，為了優(yōu)化供試品溶液的制備方法，分別考察了索氏提取4、6、8 h后萃取4次以及索氏提取6 h后萃取3、4、5次的含量測(cè)定值，結(jié)果顯示索氏提取6 h后萃取4次已經(jīng)能夠充分提取待測(cè)成分。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，還參考文獻(xiàn)方法[9-10]對(duì)處方中黃芪、枸杞子進(jìn)行了薄層色譜研究，結(jié)果在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，缺黃芪的陰性對(duì)照樣品除黃芪甲苷外，其他主斑點(diǎn)均有干擾，缺枸杞子的陰性對(duì)照樣品主斑點(diǎn)有干擾，未能進(jìn)行定性鑒別。

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StudyonQualityStandardofBushenJuanduPills

SHENG Xiaojing1*，ZHOU He1，LAI Jieren2

(1.JiujiangInstituteforFoodandDrugControl，Jiujiang332000，Jiangxi，China； 2.JiujiangCityHospitalofTraditionalChineseMedicine，Jiujiang332000，Jiangxi，China)

Objective：To establish the quality standard for Bushen Juandu Pills.MethodsThe Dioscoreae Rhizoma，Sophorae Flavescentis Radix，Bombyx Batryticatus and Curcumae Radix were identified by microscopic identification.The Cuscutae Semen，Polygoni Cuspidati Rhizoma et Rradix，Scutellariae Radix and Paeoniae Radix Rubra were identified by TLC，and the content of astragaloside was determined by HPLC-ELSD.ResultsThe microscopic characteristics were obvious，TLC spots were clear and strong specific.In the content determination method，astragaloside showed a good linear relationship at the range of 0.252 0-3.150 0 μg，r=0.999 6.The average recovery rate was 99.80%.ConclusionThe established method is accurate and reliable and easy to operate，it can be used for the quality control of Bushen Juandu pills.

Bushen Juandu Pills；quality standard；microscopic identification；TLC；HPLC-ELSD

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.019

九江市社會(huì)發(fā)展與軟科學(xué)類科研計(jì)劃項(xiàng)目(九科字[2015]44號(hào)-20)

*

盛曉靜，副主任中藥師，研究方向：中藥質(zhì)量分析；TeL：(0792)8157328，E-maiL：shengxj11@163.com

2016-10-25)