，，，

(廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司，河北 廊坊 065001)

黃色短桿菌ilvBN和ilvC基因定點突變對L-纈氨酸發(fā)酵的影響

宮衛(wèi)波，王海雷，程國平，趙津津

(廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司，河北 廊坊 065001)

以黃色短桿菌MH-1000為出發(fā)菌株，使用PCR技術(shù)克隆ilvBN與ilvC基因，對ilvBN進行定點突變，獲得解除L-纈氨酸對乙酰羥酸合酶反饋抑制突變型基因ilvBN′.對基因ilvC進行點突變，獲得乙酰羥酸變位酶突變基因ilvC′.通過重疊延伸PCR方法，將基因片段ilvBN′和ilvC′拼接為ilvBN′C′，進而連接至穿梭載體pXMJ19獲得重組質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′.該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至出發(fā)菌株獲得工程菌株MH-1032.50 L分批補料發(fā)酵結(jié)果顯示：MH-1000發(fā)酵72 h L-纈氨酸質(zhì)量濃度為35.2 g/L，MH-1032發(fā)酵72 h L-纈氨酸質(zhì)量濃度為38.4 g/L，增長9.1%，糖酸轉(zhuǎn)化率從21.7%提高到25.8%.

L-纈氨酸；乙酰羥酸合酶；乙酰羥酸變位酶；黃色短桿菌

L-纈氨酸作為增味劑、添加劑，應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域.L-纈氨酸是人體必需八種氨基酸之一.工業(yè)上主要使用發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸，所用菌種以棒桿菌為主.一般通過增強L-纈氨酸代謝通路關(guān)鍵酶、限速酶的表達[1-2]，阻斷或者減弱支路代謝[3-4]，改變細胞膜對底物和產(chǎn)物透性，增強細菌對糖等底物的耐受，抑制終產(chǎn)物分解[5-7]等方法提高L-纈氨酸產(chǎn)量.另外優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方、改善發(fā)酵工藝也可提高L-纈氨酸產(chǎn)量[8-9].徐慶陽等[10]以黃色短桿菌(B.flavum)XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)在10 L小罐中發(fā)酵72 h，最高產(chǎn)L-纈氨酸53.4 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為26.7%.張偉國等[11]通過誘變篩選出了XQ-8(Leulα+ABhr+2-TAhr+AHVhr)，搖瓶產(chǎn)酸達66 g/L.但是以誘變?yōu)榛A(chǔ)的菌株篩選效率比較低，現(xiàn)基本被基因工程手段替代.

筆者采用對ilvBNC進行定點突變的方法，解除了L-纈氨酸對乙酰羥酸合酶(AHAS)的反饋抑制，同時經(jīng)過定點突變，將乙酰羥酸變位酶(AHAIR)的輔酶NADPH改為NADH，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-纈氨酸19.5 g/L，比突變前提高16.8%；50 L發(fā)酵罐產(chǎn)L-纈氨酸38.4 g/L，比突變前提高9.1%.

1 材料與方法

1.1 材 料

大腸桿菌transT1(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，黃色短桿菌MH-1000(α-ABhr+2-TAhr+AHVhr)，廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司保藏菌種.

大腸桿菌-棒桿菌穿梭質(zhì)粒pXMJ19，本實驗所使用的菌株及載體詳見表1.

表1 本實驗中細菌和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this experiment

1.2 試劑及設(shè)備

限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶，MBI Fermentas公司；Fast pfu DNA polymerase，TransStart FastTaq DNA polymerase，TransStart FastPfu DNA polymerase，DNA Marker，dNTPs等，北京全氏金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、基因組提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；引物合成及測序送交英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成；往復(fù)式搖床、恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳-凝膠成像系統(tǒng)等；SBA生物傳感儀，山東省科學(xué)院微生物研究所；50 L發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司.

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，121 ℃滅菌20 min.

黃色短桿菌搖瓶及50 L小罐發(fā)酵培養(yǎng)基配制參考文獻[11].LBHIS(LB with brain heart infusion and sorbitol)用于電轉(zhuǎn)化后恢復(fù)培養(yǎng)，BHI(Brain heart lnfusion medium)感受態(tài)細胞培養(yǎng)等培養(yǎng)基配制參考文獻[12-13].

黃色短桿菌斜面培養(yǎng)基LBG：LB培養(yǎng)基+0.5%葡萄糖，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃滅菌20 min.

黃色短桿菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，尿素2.5 g/L，玉米漿40 g/L(氨基氮1.0%～1.3%，波美度19.5～22)，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃滅菌20 min.

黃色短桿菌50 L發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，玉米漿15 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，NaOH調(diào)節(jié)pH至 7.0，121 ℃滅菌20 min.

1.4 發(fā)酵以及數(shù)據(jù)測定

搖瓶發(fā)酵條件：搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，發(fā)酵溫度33 ℃，時間72 h.發(fā)酵結(jié)束后加水定容至20 mL；吸取菌液0.1 mL，使用0.5 mol/L鹽酸稀釋至5 mL，分光光度計測量OD562；取1 mL菌液至1.5 mL的EP管中，12 000 r/min離心2 min，安捷倫液相色譜測定L-纈氨酸產(chǎn)量；吸取1.5 mL EP管中10 μL上清液至990 μL去離子水中，SBA生物傳感儀測定發(fā)酵液剩余葡萄糖；50 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件，樣品測定參考文獻[11].

1.5 感受態(tài)細胞制備及其他分子操作

大腸桿菌感受態(tài)細胞制備參考文獻[14]，MH-1000感受態(tài)細胞制備參考文獻[15-16].基因組提取、質(zhì)粒提取、酶切和連接等按照試劑盒或說明書進行操作.引物設(shè)計參照黃色短桿菌ATCC14067相關(guān)基因(表2)，并添加相應(yīng)的酶切位點和保護堿基.

1.6 ilvBN定點突變

提取黃色短桿菌基因組，使用引物ilvBN-F和ilvBN-R經(jīng)PCR獲得ilvBN.以ilvBN為模板，分別使用ilvBN-F，ilvBN-IR和ilvBN-IF，ilvBN-R擴增兩個基因片段ilvB和ilvN.

利用重疊延伸PCR的方法，以ilvBN-F，ilvBN-R為引物，等摩爾濃度的ilvB，ilvN為模板PCR，TransStart FastTaq DNA polymerase，TransStart FastPfu DNA polymerase混合酶，體積比1∶10，體系50 μL包括：10 μL 5×Primer star buffer (Mg2+plus)，4 μL的dNTP混合物(各2.5 mmol/L)，引物各1 μL，混合酶1 μL，模板ilvB和ilvN適量，補水至50 μL.PCR條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，以上30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR結(jié)束后獲得定點突變的ilvBN′.

表2 本實驗中所用引物1)Table 2 Primers in this experiment

注：1) 表中帶有下劃線的堿基表示突變位點.

回收上步中PCR產(chǎn)物后，連接T載體pEASYTM-T5，獲得pEASYTM-T5-ilvBN′，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌；使用M13為鑒定引物測序鑒定，提取質(zhì)粒pEASYTM-T5-ilvBN′經(jīng)Hind III與EcoR I酶切，回收ilvBN′片段，與相同酶切回收的pXMJ19連接，構(gòu)建pXMJ19-ilvBN′.

轉(zhuǎn)化pXMJ19-ilvBN′至大腸桿菌，平板培養(yǎng)，挑單菌落進行搖瓶過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒作為模板，以pX-F和pX-R為引物進行PCR測序鑒定；鑒定完畢獲得陽性克隆后，提取質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′轉(zhuǎn)化MH-1000，轉(zhuǎn)化條件、培養(yǎng)基配方參考文獻[12-13]，以pX-F和pX-R為引物進行PCR測序鑒定篩選陽性克隆.

1.7 ilvC定點突變

提取黃色短桿菌基因組為模板，以ilvNC-F和ilvNC-R為引物PCR獲得ilvNC；以ilvNC為模板，分別使用ilvNC-F，ilvC-IR和ilvC-IF，ilvNC-R為引物擴增兩個基因片段ilvNCF和ilvCR.

利用重疊延伸PCR的方法，以ilvNC-F，ilvNC-R為引物，等摩爾濃度的ilvNCF和ilvCR為模板進行PCR，獲得定點突變ilvC′，連接T載體pEASYTM-T5，構(gòu)建pEASYTM-T5-ilvC′，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，24 h長出菌落后，挑單菌落或搖瓶過夜培養(yǎng)后提質(zhì)粒作為模板，T載體自帶引物M13進行PCR鑒定，測序，序列正確可用于ilvBN′C′的重疊延伸PCR.

1.8 ilvBN′與ilvC′連接、轉(zhuǎn)化

以ilvBN-F和ilvN-R為引物，ilvBN′為模板，擴增出ilvBN′F；以ilvNC-F和ilvC-R為引物，ilvC′為模板，擴增出ilvC′R.

回收上步驟中ilvBN′和ilvC′R基因片段，以ilvBN′F與ilvC′R為模板，以ilvBN-F和ilvC-R為引物，PCR擴增形成ilvBN′C′，條件基本同1.6.體系50 μL：包括10 μL 5×Primer star buffer(Mg2+plus)，4 μL的dNTP混合物(各2.5 mmol/L)，引物各1 μL，混合酶1 μL，模板ilvBN′和ilvC′R適量，補水至50 μL.PCR條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，以上30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，連接T載體pEASYTM-T5，形成pEASYTM-T5-ilvBN′C′，使用M13引物、Hind III與EcoR I雙酶切進行鑒定，鑒定陽性克隆測序.

搖瓶過夜培養(yǎng)測序正確的大腸桿菌，提取質(zhì)粒pEASYTM-T5-ilvBN′C′，使用Hind III與EcoR I酶切，回收ilvBN′C′片段后，連接同樣酶切回收的pXMJ19，構(gòu)建質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，長出菌落后挑單菌落為PCR模板，以pX-F和pX-R為引物進行PCR進行擴增，測序驗證為陽性克隆后，提取質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′轉(zhuǎn)化MH-1000，再次以pX-F和pX-R為引物，以轉(zhuǎn)化后菌株為模板進行PCR，測序篩選陽性克隆.

1.9 分批補料

50 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件：接種量10%，通風(fēng)比1 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速200～500 r/min，溫度31 ℃，25%氨水流加調(diào)節(jié)pH至7.0，流加650 g/L高濃度葡萄糖補充碳源，控制溶氧30%～50%，發(fā)酵液葡萄糖質(zhì)量濃度1～2 g/L.

2 結(jié) 果

2.1 ilvBN的定點突變及轉(zhuǎn)化

將ilvBN從MH-1000菌株基因組上擴增，使用重疊延伸PCR方法進行定點突變，將AHAS小亞基別構(gòu)中心的3個氨基酸做如下替換Gly20Asp，Ile21 Asp和Ile22 Phe，相應(yīng)的的核苷酸GGAATCATT定點突變成GATGACTTT，解除了L-纈氨酸對AHAS的反饋抑制(圖1)，獲得定點突變基因.質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′模板，以pX-F，pX-R為引物PCR驗證如圖2所示，ilvBN′大小約為2.5 kb(基因大小2 413 bp)左右(泳道2).構(gòu)建的pXMJ19-ilvBN′C′經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切，有兩條片段(泳道4)，質(zhì)粒片段pXMJ19約為6.6 kb(質(zhì)粒6 601 bp)，驗證結(jié)果為陽性，獲得MH-1031.

圖1 ilvBN基因定點突變位點及其上下游序列測序圖譜Fig.1 Site-directed mutation of ilvBN and related sequences

圖2 質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′的PCR及酶切驗證Fig.2 Validation of pXMJ19-ilvBN′C′ through PCR and endonuclease digestion

2.2 ilvC的定點突變

將ilvC從MH-1000菌株基因組中PCR擴增，對照本基因序列中氨基酸表達偏好性設(shè)計定點突變堿基(核苷酸5′-TCCCAGAACCTCCGCGATTCTGGCGTTGAGGTTGTCATT GGTCTGCG-3′)，用重疊延伸PCR方法定點突變成5′-GGCCAGAACCTCCGCGATTCT GGCGTTGAGGTTGTCA TTGGTGAGTT-3′，即氨基酸替換為Ser34Gly，Leu48Glu和Arg49Phe.這樣ilvC編碼酶的輔酶從NADPH變?yōu)镹ADH，獲得ilvC′，如圖3所示.

2.3 ilvBN′C′基因片段的拼接驗證

以質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′為模板，pX-F，pX-R為引物進行PCR驗證，如圖4所示，獲得的條帶3.5 kb(泳道2：基因大小3 610 bp)左右.質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切，理論獲得3 610 bp和6 551 bp的條帶，分別為ilvBN′C′和pXMJ19質(zhì)粒片段(圖4)，獲得條帶分別與所述相符.使用純化的ilvBN′C′的PCR產(chǎn)物測序，獲得序列除了堿基突變之外，與ATCC14067序列一致，用Vector NTI 11軟件繪制質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′圖譜，如圖5所示.

圖3 ilvC基因定點突變位點及其上下游序列測序圖譜Fig.3 Site-directed mutation of ilvC and related sequences

圖4 質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′的PCR及酶切驗證Fig.4 Validation of pXMJ19-ilvBN′C′ through PCR and endonuclease digestion

圖5 構(gòu)建的pXMJ19-ilvBN′C′質(zhì)粒圖譜Fig.5 Plasmid profile of pXMJ19-ilvBN′C′

2.4 基因工程菌的產(chǎn)L-纈氨酸情況

將已構(gòu)建的pXMJ19-ilvBN′和pXMJ19-ilvBN′C′分別轉(zhuǎn)化至MH-1000后，獲得MH-1031和MH-1032，通過20 mL/500 mL三角燒瓶和50 L發(fā)酵罐驗證3 批次，發(fā)酵時間72 h，往復(fù)式搖床振幅5 cm，170 r/min，50 L發(fā)酵OD和L-纈氨酸見圖6.

搖瓶發(fā)酵初始產(chǎn)酸16.7 g/L，MH-1031產(chǎn)L-纈氨酸18.2 g/L，比出發(fā)菌增長9.0%，MH-1032產(chǎn)L-纈氨酸19.5 g/L，比出發(fā)菌增長16.8%，比MH-1031增長7.1%；

50 L發(fā)酵罐發(fā)酵測試顯示(圖6)：MH-1031/pXMJ19-ilvBN′，MH-1032/pXMJ19-ilvBN′C′生長比MH-1000緩慢，是由于高表達質(zhì)粒所致；發(fā)酵過程葡萄糖控制1～2 g/L(曲線未給出)；出發(fā)菌MH-1000經(jīng)72 h發(fā)酵產(chǎn)L-纈氨酸35.2 g/L，MH-1031經(jīng)72 h產(chǎn)37.3 g/L，比出發(fā)菌增長6.0%，MH-1032經(jīng)72 h產(chǎn)L-纈氨酸38.4 g/L，比出發(fā)菌高9.1%，比MH-1031高2.9%(表3).

圖6 分批發(fā)酵OD和產(chǎn)酸曲線Fig.6 The curve of OD and L-val in batch of fermentation

菌株/質(zhì)粒L?纈氨酸(搖瓶)質(zhì)量濃度/(g·L-1)增長率/%L?纈氨酸(50L罐)質(zhì)量濃度/(g·L-1)增長率/%50L發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率/%出發(fā)菌MH?100016．735．221．7MH?1031/pXMJ19?ilvBN′18．29．037．36．023．3MH?1032/pXMJ19?ilvBN′C′19．516．838．49．125．8

3 結(jié) 論

50 L分批補料發(fā)酵結(jié)果顯示：出發(fā)菌株MH-1000 72 h產(chǎn)L-纈氨酸35.2 g/L，MH-1032 72 h產(chǎn)L-纈氨酸38.4 g/L，比出發(fā)菌株增長9.1%.對L-纈氨酸代謝通路的ilvBN，將AHAS小亞基別構(gòu)中心的3 個氨基酸定點突變?yōu)镚ly20Asp，Ile21 Asp和Ile22 Phe，能夠完全解除3 種支鏈氨基酸對AHAS的反饋抑制作用[7].一分子葡萄糖通過EMP途徑產(chǎn)生兩分子丙酮酸作為合成L-纈氨酸的底物，而一分子葡萄糖通過HMP途徑，通過多種酶作用，脫掉一分子碳生成五碳糖，產(chǎn)生的丙酮酸少于EMP途徑.EMP途徑甘油醛-3-磷酸脫氫酶的輔酶為NADH，HMP途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的輔酶為NADPH.NADH輔酶的序列特征是GXGXXGXXXG(X代表一種氨基酸)，而NADPH輔酶序列特征是GXGXXAXXXA，改變ilvC的氨基酸序列為Ser34Gly，Leu48Glu和Arg49Phe[1]，AHAIR能夠利用NADH作為輔酶代替NADPH，通過降低對NADPH的依賴以降低戊糖磷酸途徑的物料消耗，相對較高濃度的NADH有助于反應(yīng)向終產(chǎn)物L(fēng)-纈氨酸方向進行，進而增加L-纈氨酸產(chǎn)量.

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Site-directedmutagenesisofilvBNandilvCinBrevibacteriumflavumforimprovedproductionofL-valine

GONG Weibo, WANG Hailei, CHENG Guoping, ZHAO Jinjin

(MeiHua Biotech(Langfang) Co., Ltd., Langfang 065001, China)

Brevibacteriumflavum1000 was used as the original strain and site-specific mutagenesis was performed in itsilvBNgene, resulting in an anti-feedback inhibition geneilvBN′. The geneilvC′ encoding acetohydroxyacid isomeroreductase was obtained by site-directed mutagenesis fromilvC. The geneilvBN′C′ was obtained by overlap extension PCR fromilvBN′ andilvC, and then inserted intoE.coli-B.flavumshuttle expression vector pXMJ19 to construct a recombinant plasmid pXMJ19-ilvBN′C′. The recombinant plasmid was subsequently transformed intoB.flavumMH-1000, resulting in the strain MH-1032. The results from fed-batch fermentation experiments in 50 L fermenter indicated that the L-valine productivity of MH-1032 (38.4 g/L) was increased by 9.1% in contrast to that of MH1000 (35.2 g/L) in 72 hours, and the conversion of glucose to L-val increased from 21.7% to 25.8%.

L-valine;Brevibacteriumflavum; acetohydroxyacid synthase; acetohydroxyacid isomeroreductase

2017-08-02

宮衛(wèi)波(1979—)，男，河北邯鄲人，碩士，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:gongweibo@meihuagrp.com.

TQ922

A

1674-2214(2017)04-0228-05

朱小惠)