，，

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 制藥工程學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

惡臭假單胞菌產(chǎn)羰基還原酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

何軍邀1,2，白東亞2，王普2

(1.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校 制藥工程學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

從土樣中篩選得到一株產(chǎn)羰基還原酶的菌種惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1606，該菌能不對稱催化2′-三氟甲基苯乙酮合成(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，對映體過量值超過99.0%.通過單因素考察產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成發(fā)現(xiàn)：葡萄糖、牛肉膏和MgSO4·7H2O對酶活的影響較為明顯，進一步采用響應(yīng)面法對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行了優(yōu)化.結(jié)果表明：最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖38.5 g/L，牛肉膏32.7 g/L，MgSO4·7H2O 1.1 g/L.在最適培養(yǎng)條件下，菌體酶活力達0.31 U/g，較優(yōu)化前提高了71.0%.該研究結(jié)果豐富了羰基還原酶數(shù)據(jù)庫的基因序列，為高效合成(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇提供了新途徑.

惡臭假單胞菌；羰基還原酶；菌種篩選；(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇；培養(yǎng)基優(yōu)化

手性仲醇含有一個活潑的羥基官能團，是用于合成藥物、香精香料、農(nóng)業(yè)化學(xué)品和特殊材料的重要手性砌塊[1-2].利用生物催化技術(shù)將潛手性酮不對稱還原成為手性仲醇，是合成手性仲醇可靠和有效的方法[3-4].由于生物催化不對稱還原具有立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點，已經(jīng)成為近年來的研究熱點[5-8].(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇是合成抗腫瘤藥物GSK461364的關(guān)鍵手性中間體，GSK461364(化學(xué)名：5-[6-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-1H-苯并咪唑-1-基]-3-[(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙氧基]-2-噻吩胺)是ATP競爭性抑制劑，強選擇性作用于受體Plk1激酶抑制劑，可調(diào)控細(xì)胞有絲分裂，用于治療晚期實體瘤和非Hodgkins淋巴瘤[9].(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的制備主要包括化學(xué)法[10]和生物法[11-12].Martins等[10]采用IrCl3/(R,R)-TsDPEN為催化劑，底物2′-三氟甲基苯乙酮的濃度為1 mol/L，反應(yīng)24 h，主產(chǎn)物為R型，轉(zhuǎn)化率和e.e.值分別為100%和75%，產(chǎn)物的光學(xué)純度不理想.該手性醇的生物法制備也已有一些報道，如Nakamura等[11]采用白地霉(Geotrichumcandidum)為催化劑，以26.7 mmol/L 2′-三氟甲基苯乙酮為底物，添加NAD+和異丙醇參與輔酶再生，30 ℃，反應(yīng)20 h制得S構(gòu)型產(chǎn)物，產(chǎn)率和e.e.值分別為13%和97%.許建和等[12]采用基因挖掘技術(shù)，構(gòu)建重組工程菌E.ColiBL21(DE3)/pET-KtCR，底物濃度為10 mmol/L條件下，得到R構(gòu)型產(chǎn)物的產(chǎn)率和e.e.值分別為2%和99%.

筆者通過篩選取自全國各地的35 份土樣，得到一株產(chǎn)羰基還原酶菌種惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1606，該菌株能高立體選擇性不對稱還原2′-三氟甲基苯乙酮，產(chǎn)物(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的e.e.值超過99.0%.為提高產(chǎn)酶能力，通過單因素進行考察，并對重要影響因素采用中心組合實驗設(shè)計(Central composite design)，優(yōu)化菌種發(fā)酵培養(yǎng)基組成，確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件.

1 材料與方法

1.1 菌種與材料

1.1.1 菌 種

惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1606，由本課題組從土壤中篩選得到.

1.1.2 試 劑

2′-三氟甲基苯乙酮購自韶遠(yuǎn)科技(上海)有限公司，外消旋1-(2-三氟甲基苯基)乙醇由實驗室合成制得(純度>97.1%).其他試劑為國產(chǎn)生化試劑或分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：鄰三氟甲基苯乙酮4.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.5.

固體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，酵母提取物6.0 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，KH2PO41.5 g/L，NaCl 0.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH 6.5.

種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15.0 g/L，酵母提取物10.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.5.

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種篩選

10 mL的生理鹽水中加入1 g土樣并搖勻，吸取200 μL懸濁液加入富集培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5～7 d.將富集培養(yǎng)基分別稀釋100～10 000 倍，各吸取100 μL涂布在平板培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d.對平板培養(yǎng)基長出的菌株進行轉(zhuǎn)化能力考察，選取優(yōu)良菌株.篩菌流程：富集培養(yǎng)→平板初篩→菌種復(fù)篩→種子培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→生物轉(zhuǎn)化→氣相色譜檢測產(chǎn)物→獲得優(yōu)良菌株.

1.2.2 菌種鑒定

利用Hitachi(日立)-7650透射電子顯微鏡觀察ZJPH1606菌的細(xì)胞形態(tài)，并由上海生工測序16S rDNA，將所得基因序列對比分析GenBank保藏的基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌的種屬.

1.2.3 種子培養(yǎng)

從培養(yǎng)成熟的平板培養(yǎng)基中挑取1環(huán)菌體接入裝液量為100 mL的種子培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶)，溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)12 h.

1.2.4 搖床發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液以8%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接至裝有60 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)36 h.

1.2.5 中心組合實驗設(shè)計

對初始培養(yǎng)基成分中的碳源、氮源及金屬離子的種類及濃度進行優(yōu)化，通過單因素實驗法，選取葡萄糖、牛肉膏和MgSO4·7H2O三個重要因素，利用Design expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計(三因素三水平)，以酶活(U/g)為響應(yīng)值，共需17 組實驗，每組設(shè)3 個平行樣.實驗設(shè)計軟件Design expert 8.0.6對實驗數(shù)據(jù)自動進行回歸分析，用F(Fischer)檢驗評價數(shù)學(xué)模型方程的顯著性，由確定系數(shù)R2確定方程的擬合性.

1.2.6 酶活力測定

酶活力定義：30 ℃，200 r/min下，1 min還原2′-三氟甲基苯乙酮生成1 μmol (R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇所需的酶量定義為一個酶活力單位(U).羰基還原酶的酶活力(Enzyme activity)以1 g干菌體中所含有的酶活力單位表示(U/g).

酶活力測定方法：取發(fā)酵液，離心分離菌體(9 000×g，4 ℃，15 min)，以磷酸鹽緩沖溶液PBS(0.1 mol/L，pH 6.5)洗滌，離心后稱取菌體(濕重)1.0 g重懸于10 mL磷酸緩沖液中，加入5 mmol/L 2′-三氟甲基苯乙酮，1 g乳糖，溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)1 h，離心后上清液用10 mL乙酸乙酯萃取，用氣相色譜檢測產(chǎn)物濃度，計算其酶活力.

1.2.7 氣相分析方法

GC-2014氣相色譜儀(日本SHIMADZU公司),氣相柱為CP-Chirasil-Dex毛細(xì)管手性色譜柱(25 m×0.25 mm×0.25 μm)；氮氣作為載氣，柱流速2.0 mL/min；升溫程序為柱溫100 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升至150 ℃；進樣口溫度250 ℃；檢測器為FID，溫度250 ℃；進樣量1 μL，分流比15∶1.氣相色譜圖如圖1所示，溶劑(乙酸乙酯)保留時間為1.121 min，內(nèi)標(biāo)(十二烷)保留時間為6.035 min，S構(gòu)型產(chǎn)物醇保留時間為7.953 min，R構(gòu)型產(chǎn)物醇保留時間為8.215 min.產(chǎn)物的光學(xué)純度由對映體過量值e.e.表征為

圖1 產(chǎn)物氣相色譜分析圖Fig.1 GC analysis of the product

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選與鑒定

通過初篩和復(fù)篩，從土樣中篩選得到一株產(chǎn)羰基還原酶菌株ZJPH1606，能高選擇性催化合成(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇(產(chǎn)物e.e.值>99.0%).經(jīng)保守序列對比，該菌與惡臭假單胞菌(Pseudomonassp. PcFRB017，GenBank登錄號為No. AB548844.1)的相似度為100%.菌落形態(tài)：菌落呈乳白色，表面濕潤，光滑有光澤，不規(guī)則狀，略微凸起.細(xì)胞形態(tài)：細(xì)體呈粗細(xì)不均的短桿狀[(0.3～0.7) μm×(0.9～3.5) μm]，可單個或聚集成叢，革蘭氏染色呈陰性.結(jié)合菌體形態(tài)和基因保守序列對比分析，鑒定該菌為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1606，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號：CCTCC M 2017110.

2.2 單因素實驗考察

培養(yǎng)基成分(如碳源、氮源及金屬離子)的組成及濃度對菌體酶活和生物量影響較大，優(yōu)化實驗以酶活為主要考察指標(biāo)，首先確定碳源、氮源組成，再通過優(yōu)化培養(yǎng)基各成分質(zhì)量濃度以提高酶活.

實驗選取了葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油和蔗糖作為唯一碳源，考察碳源對菌體生物量和酶活的影響，結(jié)果表明：以葡萄糖為碳源時，酶活力最高.進而考察了葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活力的影響，結(jié)果如圖2所示，在初始質(zhì)量濃度為10 g/L時酶活為0.09 U/g，而在35.0 g/L時酶活最高達到0.20 U/g.

實驗從蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、乙酸銨、(NH4)2SO4和NH4Cl等氮源中優(yōu)選牛肉膏作為P.putidaZJPH1606氮源，考察了其質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果顯示當(dāng)質(zhì)量濃度為30.0 g/L時酶活達到0.25 U/g(圖3).

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活及菌體生物量的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on the enzyme activity and biomass

圖3 牛肉膏質(zhì)量濃度對酶活及菌體生物量的影響Fig.3 Effect of beef extract concentration on the enzyme activity and biomass

考察了金屬離子對酶活的影響，金屬離子的添加質(zhì)量濃度為0.25 g/L，選取CaCl2，CoCl2，F(xiàn)eSO4，Li2SO4，ZnSO4，MnSO4，Ni2SO4添加到培養(yǎng)基中，替代原初始培養(yǎng)基中的NaCl，KH2PO4和MgSO4·7H2O，以及對原培養(yǎng)基中的三種離子化合物進行篩選，考察菌體生物量和酶活的變化情況.表1結(jié)果表明：在原培養(yǎng)基中添加其他金屬離子，酶活都有不同程度降低；去除原培養(yǎng)基中的Na+和K+，酶活變化不明顯，而Mg2+的去除，酶活由0.24 U/g降低到0.14 U/g，降低了41.7%.因此，選出Mg2+為影響酶活的重要影響因素，并對其質(zhì)量濃度進行優(yōu)化.由圖4可知：當(dāng)MgSO4的質(zhì)量濃度為0.8 g/L時，酶活達到最高0.28 U/g.

表1金屬離子對菌體生物量及酶活影響

Table1Effectofdifferentmetalionsonthebiomassandenzymeactivity

離子種類1)酶活/(U·g-1)生物量/(g·L-1)Ca2+0．17±0．018．42±0．03Fe2+0．11±0．038．81±0．06Mn2+0．14±0．018．85±0．02Li+0．15±0．017．56±0．02Zn2+0．13±0．047．16±0．04Ni+0．11±0．026．42±0．03Co2+0．08±0．050．14±0．07Na+(-)0．22±0．018．28±0．02Mg2+(-)0．14±0．018．15±0．01K+(-)對照0．23±0．020．24±0．019．42±0．038．43±0．02

注：1) (-)代表此組實驗不添加該金屬離子.

圖4 MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度對酶活及菌體生物量的影響Fig.4 Effect of single MgSO4·7H2O concentration on the enzyme activity and biomass

2.3 中心組合實驗設(shè)計

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件是普遍有效的方法[13-14].響應(yīng)面實驗所考察的是在一定范圍內(nèi)各因素最優(yōu)比，無法對所選濃度范圍之外的情況進行分析，因此在設(shè)計響應(yīng)面試驗時，先通過最陡爬坡實驗確定不同因素的濃度選取范圍，使顯著因素葡萄糖、牛肉膏和MgSO4·7H2O的濃度取值趨近于最優(yōu)點.在單因素實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對所選顯著變量分別按2.5，2.5，0.2的步長配制培養(yǎng)基.如表2所示，五種培養(yǎng)基組成中，序號3驗證組的菌體酶活力最高(0.28 U/g)，說明該組變量取值更趨近于最優(yōu)點.因此，選擇3號實驗組中的發(fā)酵培養(yǎng)基配比為中心點，進行響應(yīng)面實驗設(shè)計.

表2 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of steepest ascent

按照Box-Behnken實驗的設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面實驗，以葡萄糖X1，牛肉膏X2，MgSO4·7H2OX3三個因素為自變量，酶活作為響應(yīng)值，設(shè)計N=17的三因素三水平實驗，并對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到擬合方程模型.各因素編碼值及水平如表3所示，實驗設(shè)計及實驗結(jié)果見表4.

表3 響應(yīng)面分析實驗因素水平Table 3 Factors and levels of response surface experiment g/L

表4Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果

Table4ResponsesurfaceBox-Behnkendesignandcorrespondingresults

試驗號X1X2X3酶活/(U·g-1)10-110．212-1100．2030000．33410-10．185-10-10．1761010．177-1-100．1780000．309-1010．23100000．331101-10．19120000．31130000．31141100．19150110．22160-1-10．17171-100．16

采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計，確定顯著影響因子的最優(yōu)水平.由SAS 8.0軟件擬合得到多元回歸模型為：

酶活=0.32-8.75×10-3X1+1.12×10-2X2+1.50×10-2X3-0.486X1X2-1.75×10-2X1X3-2.50×10-3X2X3-0.07X12-0.06X22-0.05X32

利用Design expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行二次多項式方差分析，結(jié)果如表5所示.該模型P=0.000 1<0.05，失擬值為0.570 5，表明該模型分析結(jié)果可信，各因素對酶活影響顯著.決定系數(shù)R2=0.988 1，說明該模型預(yù)測值與實際值相關(guān)聯(lián)度高，可以用于預(yù)測實驗結(jié)果.由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合繪制響應(yīng)面，如圖5～7所示.

表5 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table 5 Significance test of the regression coefficients

圖5 葡萄糖和牛肉膏質(zhì)量濃度對酶活的影響Fig.5 Effect of glucose and beef extract concentration on enzyme activity

圖6 牛肉膏和MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度對酶活的影響 Fig.6 Effect of beef extract and MgSO4·7H2O concentration on enzyme activity

圖7 葡萄糖和MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度對酶活的影響 Fig.7 Effect of glucose and MgSO4·7H2O concentration on enzyme activity

由響應(yīng)面圖5～7可知：兩兩因素葡萄糖/牛肉膏，牛肉膏/MgSO4·7H2O，葡萄糖/MgSO4·7H2O構(gòu)成的響應(yīng)面，其圖形均呈現(xiàn)上凸的山丘狀，表明酶活存在極大值；經(jīng)對酶活數(shù)據(jù)進行分析，預(yù)測最大酶活為0.32 U/g，三因素最優(yōu)質(zhì)量濃度分別為葡萄糖38.5 g/L，牛肉膏32.7 g/L，MgSO4·7H2O 1.1 g/L.

驗證模型預(yù)測值準(zhǔn)確性的實驗表明：在最優(yōu)化條件下進行5 組250 mL搖瓶發(fā)酵實驗，酶活分別為0.31，0.32，0.30，0.31，0.32 U/g，其平均酶活為0.31 U/g，與預(yù)測值(0.32 U/g)非常接近，相對誤差為3.1%，表明該模型能較準(zhǔn)確地預(yù)測發(fā)酵水平.

3 結(jié) 論

從土樣中篩選得到一株產(chǎn)羰基還原酶的菌株，經(jīng)鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1606，該菌能高選擇性催化底物制備(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇.利用單因素實驗，確定最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖35.0 g/L，牛肉膏30.0 g/L，MgSO40.8 g/L.進一步利用中心組合實驗得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成：葡萄糖38.5 g/L，牛肉膏32.7 g/L，MgSO4·7H2O 1.1 g/L.在優(yōu)化條件下，酶活由初始酶活0.09 U/g提高到0.31 U/g，較優(yōu)化前提高了71.0%.菌株ZJPH1606所產(chǎn)羰基還原酶具很好的催化選擇性，產(chǎn)物e.e.值>99.0%，具有較好的應(yīng)用前景.

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OptimizationoffermentationconditionsforcarbonylreductaseproductionbyPseudomonasputida

HE Junyao1,2, BAI Dongya2, WANG Pu2

(1.Department of Pharmaceutical Engineering, Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo 315100, China; 2.College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

A bacterial strainPseudomonasputidaZJPH1606 containing carbonyl reductase was screened out from soil, which can reduce 2′-(Trifluoromethyl)acetophenone to (R)-1-[2-(trifluoromethyl)phenyl] ethanol with enantiomeric excess (e.e.) higher than 99.0%. By single factor experiment, glucose, beef extract and MgSO4·7H2O were found to be significant factors influencing the carbonyl reductase production. In order to improve the enzyme production, the medium components were further optimized by response surface methodology. The results showed that the enzyme activity reached highest when the fermentation medium was composed of glucose 38.5 g/L, beef extract 32.7 g/L, MgSO4·7H2O 1.1 g/L. Under the optimum conditions, the enzyme activity reached 0.31 U/g, increased by 71.0% compared to the original medium components. This study enriched the gene sequences database of carbonyl reductase and provided a new approach for the efficient synthesis of (R)-1-[2-(trifluoromethyl)phenyl] ethanol.

Pseudomonasputida; carbonyl reductase; strain screening; (R)-1-[2-(trifluoromethyl)phenyl]ethanol; medium optimization

2017-08-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(21676250)；浙江省公益技術(shù)研究項目(2015C33137)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY16B060010)；寧波市科技創(chuàng)新團隊資助項目(2015C110027)

何軍邀(1974—)，男，浙江寧海人，教授，博士，研究方向為生物催化與生物轉(zhuǎn)化，E-mail：hejunyao1974@126.com.

TQ033/O643

A

1674-2214(2017)04-0243-06

朱小惠)