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(1.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司 博士后科研工作站，河南 項城 466200；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院， 天津 300457；3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457)

玉米漿和表面活性劑添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

韓洪軍1，高立棟1，張順棠1，李燕軍1,2,3，陳寧2,3

(1.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司 博士后科研工作站，河南 項城 466200；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院， 天津 300457；3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457)

首先研究了添加玉米漿和表面活性劑吐溫對谷氨酸棒狀桿菌GKGD發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸的影響.在此基礎(chǔ)上，通過采用添加過量玉米漿，同時在產(chǎn)酸期添加吐溫60的培養(yǎng)方法，顯著提高了α-酮戊二酸的產(chǎn)量.結(jié)果表明：相比于吐溫80，吐溫60更有利于α-酮戊二酸的分泌；在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加6 mL/L玉米漿，在發(fā)酵10 h加入1 mL/L吐溫60，可以使α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度達到17.9 g/L.

谷氨酸棒桿菌；α-酮戊二酸；玉米漿；表面活性劑

α-酮戊二酸作為三羧酸循環(huán)的重要中間代謝物，連接著細胞內(nèi)的碳氮代謝.同時其本身也是一種多功能的有機酸，在醫(yī)藥、食品和化工領(lǐng)域具有廣泛的用途[1-2].α-酮戊二酸可以通過化學(xué)法和微生物發(fā)酵法合成，目前化學(xué)法占主導(dǎo)地位[3].然而，化學(xué)合成法多以氰化物為底物，存在產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物、反應(yīng)路線長和需要催化劑等缺點.相比之下，微生物發(fā)酵法清潔環(huán)保，發(fā)展?jié)摿薮骩4].目前研究者們多以解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)來發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸[5-6]，然而其發(fā)酵周期長、副產(chǎn)物多.由于α-酮戊二酸是谷氨酸生物合成的直接前體，本研究團隊在前期工作中從谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌GKG-047出發(fā)，敲除谷氨酸脫氫酶1和2，通過雙階段pH和生物素控制策略實現(xiàn)了谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)α-酮戊二酸，且生產(chǎn)強度為目前報道最高[7].后續(xù)，筆者團隊研究了強化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶[8]和減少代謝副產(chǎn)物[9]對α-酮戊二酸積累的影響.

α-酮戊二酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌GKGD為生物素缺陷型.生物素是脂肪酸合成所需的輔酶，是細胞正常生長所必需的，其限量供應(yīng)會影響脂肪酸的合成和細胞膜的通透性[7].因此，谷氨酸和α-酮戊二酸發(fā)酵過程采取生物素亞適量的工藝，既能滿足發(fā)酵前期菌體必要的生長，又在大量產(chǎn)酸期保證細胞高通透性和產(chǎn)物分泌.然而，這種發(fā)酵工藝菌體生物量往往不會太高，筆者嘗試采用高生物素促進菌體生長，以及添加表面活性劑促進產(chǎn)物分泌的發(fā)酵新工藝.課題組前期研究表明：玉米漿中含有高質(zhì)量濃度的生物素(約6 μg/mL)，既可以為菌體生長提供豐富的有機氮源，又調(diào)控著細胞的轉(zhuǎn)型和產(chǎn)物的分泌.當玉米漿添加濃度過高時，菌體大量繁殖而細胞不能轉(zhuǎn)型，產(chǎn)酸水平很低.吐溫作為一種常見的表面活性劑，在發(fā)酵過程中添加吐溫，可以改變細胞膜的通透性.通過搖瓶發(fā)酵分別研究玉米漿和吐溫添加濃度對α-酮戊二酸產(chǎn)量的影響，旨在探究新的α-酮戊二酸發(fā)酵控制工藝，即通過添加高生物素促進菌體生物量積累，同時添加吐溫增加細胞通透性以解決細胞不能轉(zhuǎn)型的問題.

1 材料與方法

1.1 菌 株

α-酮戊二酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌GKGD，保藏于天津科技大學(xué)代謝工程研究室.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨4 g/L，玉米漿5 mL/L，谷氨酸鈉2.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂25 g/L.pH 7.0～7.2，0.1 MPa滅菌20 min.

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L，玉米漿20 mL/L，KH2PO43 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，MnSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，尿素5 g/L，pH 7.0～7.2，0.1 MPa滅菌20 min.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，KH2PO41.2 g/L，味精10 g/L，玉米漿3 mL/L，酵母粉5 g/L，消泡劑1 滴，pH 7.0～7.2，0.1 MPa滅菌15 min.

1.3 主要儀器

生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；振蕩培養(yǎng)箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；SBA-40C生物傳感儀，山東省科學(xué)院；高效液相色譜儀，日本島津公司.

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面培養(yǎng)基，32 ℃恒溫靜置培養(yǎng)10～14 h.

1.4.2 種子培養(yǎng)

用接種針取一環(huán)生長良好的活化斜面種子，轉(zhuǎn)接入裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，9 層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，200 r/min，32 ℃振蕩培養(yǎng)8 h.

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

按照體積分數(shù)10%接種量，將培養(yǎng)8 h的種子液接種于含有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，9 層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，200 r/min，32 ℃振蕩培養(yǎng)32 h.

1.5 分析方法

1.5.1 pH測定

采用pH 6.4～8.0精密pH試紙測定.

1.5.2 菌體OD測定

取發(fā)酵液用蒸餾水稀釋20 倍，采用752型分光光度計測定600 nm波長下的吸光度.

1.5.3 殘?zhí)菧y定

采用SBA-40C生物傳感儀測定.

1.5.4 α-酮戊二酸產(chǎn)量測定

發(fā)酵液13 000 r/min離心2 min，取上清液稀釋100 倍，利用高效液相色譜法測定α-酮戊二酸含量.色譜條件：色譜柱為伯樂Aminex HPX-87H，流動相為5 mmol/L的硫酸，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長215 nm，進樣量20 μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米漿添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

玉米漿是一種用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡水濃縮物，含有豐富的氨基酸、核酸、維生素和無機鹽等，其中生物素對谷氨酸棒桿菌GKGD產(chǎn)α-酮戊二酸尤為重要.生物素作為菌體細胞膜合成的必要元素，能夠調(diào)節(jié)細胞膜的通透性，同時也是羧化酶系等關(guān)鍵酶的輔酶，對細胞中心代謝具有重要的調(diào)控作用.GKGD來源于生物素亞適量型谷氨酸生產(chǎn)菌GKG-047，α-酮戊二酸作為合成谷氨酸的直接前體，生物素含量在其發(fā)酵過程中也起著重要的調(diào)控作用[7].筆者在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1，3，5，7，9 mL/L的玉米漿，菌體生物量和α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度如圖1所示.

柱狀—α-酮戊二酸；曲線—OD600圖1 玉米漿對菌體生長和α-酮戊二酸質(zhì)量濃度的影響 Fig.1 Effects of corn steep liquor addition on bacterial growth and α-ketoglutarate production

從圖1可知：當玉米漿添加量較少時，α-酮戊二酸質(zhì)量濃度隨著玉米漿添加量的增加而顯著提高，當玉米漿添加量為3 mL/L時，α-酮戊二酸的積累量達到最大值.然而，當玉米漿添加量繼續(xù)升高時，α-酮戊二酸質(zhì)量濃度逐漸降低.玉米漿中所含有的生物素是菌體生長以及α-酮戊二酸積累的關(guān)鍵因素.玉米漿添加量不足時，導(dǎo)致菌體量過少，從而使得產(chǎn)酸嚴重下降；若添加玉米漿過量，則導(dǎo)致菌體生長過盛，能量代謝流向細胞生長，而不利于產(chǎn)酸.所以添加適量的玉米漿，對于菌體的生長以及酮戊二酸的代謝積累至關(guān)重要.綜上所述，玉米漿的最適添加體積分數(shù)為3 mL/L，此時α-酮戊二酸質(zhì)量濃度為12.1 g/L.

2.2 表面活性劑添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

吐溫(或聚山梨酯)為非離子型表面活性劑，可以改善細胞的通透性，改善細胞與氧的接觸，從而促進酶和代謝產(chǎn)物的分泌與生產(chǎn).但吐溫添加時間過早不利于菌體的生長，所以將吐溫的添加時間確定為菌體生長的穩(wěn)定期(發(fā)酵10 h以后)，既能確保發(fā)酵過程中具有一定的菌體量，同時又可以增強細胞將α-酮戊二酸分泌到胞外的能力.筆者比較研究了兩種表面活性劑(吐溫60、吐溫80)促進菌體分泌α-酮戊二酸的作用.兩種表面活性劑在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加體積分數(shù)分別為0.5，1，2，5 mL/L，α-酮戊二酸的產(chǎn)量如圖2所示.

圖2 表面活性劑吐溫60/吐溫80對α-酮戊二酸質(zhì)量濃度的影響 Fig.2 Effects of surfactants (Tween 60/Tween 80) addition on α-ketoglutarate production

由圖2可知：吐溫80和吐溫60雖然都是表面活性劑，但對于膜透性的作用卻有明顯區(qū)別，在添加量為0.5，1，2 mL/L時，吐溫60對于菌體分泌α-酮戊二酸的效果更加明顯.當吐溫60添加量為1 mL/L時，α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度最高，達到11.7 g/L.

2.3 玉米漿和表面活性劑的復(fù)合添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

玉米漿會影響發(fā)酵過程中菌體量的多少和代謝流的分配，在菌體生長穩(wěn)定期加入表面活性劑可以增強細胞分泌α-酮戊二酸的能力.因此，為了達到通過增加菌體量來提高α-酮戊二酸產(chǎn)量的目的，在發(fā)酵過程中添加玉米漿，同時在穩(wěn)定期加入吐溫60來促進α-酮戊二酸的分泌.在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同體積分數(shù)玉米漿，在發(fā)酵10 h時添加不同體積分數(shù)的吐溫60.以添加3 mL/L玉米漿、1 mL/L吐溫60為對照，在玉米漿添加量為6 mL/L和9 mL/L時，均分別添加1 mL/L和2 mL/L的吐溫60，α-酮戊二酸的產(chǎn)量如圖3所示.

從圖3可知：當采取上述單獨優(yōu)化確定的最適體積分數(shù)的玉米漿(3 mL/L)和吐溫60(1 mL/L)組合時，α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度為12.8 g/L，略微高于單獨添加實驗的最高值；當添加6 mL/L玉米漿，且添加吐溫60時，α-酮戊二酸積累量顯著提高，吐溫60添加量為1 mL/L時，α-酮戊二酸質(zhì)量濃度達到最高值(17.9 g/L)；然而，當玉米漿添加體積分數(shù)提高到9 mL/L時，且添加1 mL/L或2 mL/L吐溫60，α-酮戊二酸產(chǎn)量提高不明顯.因此，采用添加過量玉米漿，同時添加適量吐溫60的培養(yǎng)方式，可以有效提高產(chǎn)物的積累和分泌.

1—玉米漿3 mL/L，吐溫 60 1 mL/L；2—玉米漿6 mL/L，吐溫60 1 mL/L；3—玉米漿6 mL/L，吐溫60 2 mL/L；4—玉米漿9 mL/L，吐溫60 1 mL/L；5—玉米漿 9 mL/L，吐溫60 2 mL/L 圖3 玉米漿和吐溫60復(fù)合添加對α-酮戊二酸質(zhì)量濃度的影響 Fig.3 Combinational addition of corn steep liquor and Tween 60 on α-ketoglutarate production

3 結(jié) 論

在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵產(chǎn)α-酮戊二酸的過程中，玉米漿的添加量對α-酮戊二酸生產(chǎn)至關(guān)重要，在穩(wěn)定期添加一定量的吐溫60能夠促進α-酮戊二酸的分泌.通過添加過量玉米漿以促進菌體生長，同時在穩(wěn)定期(產(chǎn)酸期)添加適量吐溫60，可以

有效提高α-酮戊二酸的產(chǎn)量.最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿的添加量為6 mL/L，在發(fā)酵開始10 h后加入1 mL/L的吐溫60，α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度達到最高值17.9 g/L.

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Influenceoftheadditionofcornsteepliquorandsurfactantsonfermentativeproductionofα-ketoglutarate

HAN Hongjun1, GAO Lidong1, ZHANG Shuntang1, LI Yanjun1,2,3, CHEN Ning2,3

(1.Post-Doctoral Research Center, Lotus Health Group Co., Ltd., Xiangcheng 466200, China; 2.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 3.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China)

In this study, the influence of corn steep liquor and surfactants addition on fermentative production of α-ketoglutarate byCorynebacteriumglutamicumGKGD was investigated. The production of α-ketoglutarate was significantly improved by adding corn steep liquor in the initial fermentation medium and adding appropriate amount of Tween 60 at the beginning of acid-producing phase. The results indicated that Tween 60 was more effective in promoting the secretion of α-ketoglutarate than Tween 80. The α-ketoglutarate production achieved the highest value of 17.9 g/L with 6 mL/L of corn steep liquor and 1 mL/L of Tween 60 added.

Corynebacteriumglutamicum; α-ketoglutarate; corn steep liquor; surfactant

2017-09-01

中國博士后科學(xué)基金資助項目(2016M601269)

韓洪軍(1966—)，男，河南沈丘人，高級工程師，研究方向為發(fā)酵工程和農(nóng)產(chǎn)品深加工，E-mail：lhhhj5539@163.com.

TQ92

A

1674-2214(2017)04-0216-04

朱小惠)