朱淑芬 納仁高娃

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ADAM33基因T1位點(diǎn)多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙、漢民族人群哮喘的相關(guān)性研究

朱淑芬1納仁高娃2

目的 探討解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)基因T1位點(diǎn)(rs2280091)不同基因型及等位基因的分布頻率與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙、漢民族支氣管哮喘的關(guān)系。方法 選用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對(duì)漢族哮喘患者112例、蒙古族哮喘患者105例進(jìn)行ADAM33基因多態(tài)性的檢測(cè)，并分別與110例健康漢族和108例健康蒙族進(jìn)行比較，篩選有意義基因。結(jié)果 內(nèi)蒙古地區(qū)蒙、漢族人群均可檢出T1位點(diǎn)3種基因型(AA、AG、GG),在蒙、漢族支氣管哮喘組分布頻率分別與健康對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，漢族哮喘組AG、GG基因型OR值分別為0.183、 0.38，蒙古族哮喘組AG、GG基因型OR值分別為 0.295 、 0.851；蒙、漢族支氣管哮喘組T1位點(diǎn)等位基因A和G基因頻率分別與健康對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，G等位基因OR值及95%可信區(qū)間分別為0.372(0.190-0.729)、0.237(0.111-0.509)。結(jié)論 內(nèi)蒙古地區(qū)ADAM33基因T1位點(diǎn)基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙、漢族人群哮喘發(fā)病可能相關(guān)。

解整合素-金屬蛋白酶33; 哮喘; 基因多態(tài)性; PCR-RFLP;蒙族；漢族

支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘，是常見的慢性氣道疾病之一，因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及免疫、遺傳、環(huán)境等諸多因素，故在基因?qū)W角度，尋找易感基因至關(guān)重要。解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)基因是近年來哮喘發(fā)病的研究熱點(diǎn)[1]。因此本課題使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙、漢民族人群支氣管哮喘患者與ADAM33基因T1位點(diǎn)多態(tài)性關(guān)系進(jìn)行研究，進(jìn)一步從免疫遺傳學(xué)角度探討蒙、漢民族支氣管哮喘發(fā)病的遺傳學(xué)特征。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2014-2015年就診于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診及住院部的蒙古族、漢族支氣管哮喘患者(分別為105例、110例)為病例組，其中漢族哮喘組，男60例，女50例，最小年齡22歲，最大年齡80 歲，平均年齡(44±12.7)歲；蒙古族哮喘組，男54例，女51例，最小年齡17歲，最大年齡75歲，平均年齡(37±10.5)歲。收集病例均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)哮喘學(xué)組修訂的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。并選同期健康體檢的蒙、漢族人群(分別為108例、112例)作為對(duì)照，研究對(duì)象年齡、性別構(gòu)成，比較差異無顯著性(P<0.05)。入選人員均符合祖籍三代及三代以上居住在內(nèi)蒙古地區(qū)無血緣關(guān)系、無異族通婚史，無過敏性疾病病史，無高血壓、糖尿病等慢性基礎(chǔ)疾病、無腫瘤、自身免疫性疾病及其它家族性遺傳疾病的病史。

二、方法

1 基因組DNA提取:采患者外周靜脈血2mL，EDTA(INSEPACK，ST520EK)抗凝，采用全血基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP348-02)提取DNA。

2 引物： T1位點(diǎn)(rs2280091)引物序列，上游引物: 5'-ACTCAAGGTGACTGGGTGCT-3'下游引物: 5'-GAGGGCATGAGGCTCACTTG-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大約為400bp，由上海生物工程公司合成。

3 PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系總體系為20μL，包括：基因組DNA 1μL，Extaq Mix 10 μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 7 μL；PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min，95℃ 變性20 s，68℃ 退火20s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè): T1位點(diǎn)檢測(cè)使用限制性內(nèi)切酶NcoI酶進(jìn)行。酶切體系: 總體系為20μL，擴(kuò)增的PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μL，限制性內(nèi)切酶0.5μL，ddH2O 7.5μL，10×NEBuffer液2μL，37 ℃放置1小時(shí)；65℃放置20分鐘。酶切產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120V，時(shí)間為30 min，然后放入凝膠成像儀中保存結(jié)果，進(jìn)行圖像分析。

5 DNA序列測(cè)定:將擴(kuò)增好的PCR片段送往上海英俊生物技術(shù)有限公司行DNA序列測(cè)定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、T1 位點(diǎn)的基因型檢測(cè)結(jié)果

1. T1位點(diǎn)突變類型為A/G。AA基因型：可被NcoI酶完全酶切，酶切產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別為144bp和256bp；AG基因型：可被部分酶切，得到3個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為144bp、256bp和400bp，GG基因型：不可被酶切，產(chǎn)物長(zhǎng)度為400bp，(見圖1)。

圖1 T1引物PCR產(chǎn)物NcoI酶切電泳圖

1泳道為Marker DL500， 2、5泳道為純合GG基因型；3、6泳道為純合AA基因型；4、7泳道為雜合AG基因型

2. T1位點(diǎn)基因測(cè)序，見圖2。

二、漢族哮喘與健康漢族人群比較

表1 漢族哮喘與健康漢族人群ADAM33基因T1位點(diǎn)基因型分布頻率和等位基因頻率比較[n(%)]

T1基因型及等位基因健康漢族(n=110)漢族哮喘(n=112)χ2POR95%CIAA79(71.82)104(92.85)1AG29(26.36)7(6.25)0.1830.076-0.440GG2(1.82)1(0.9)17.1760.0000.380.340-4.264A187(85.00)215(95.98)G33(15.00)9(4.02)15.6300.0000.2370.111-0.509

漢族哮喘組與健康漢族組的ADAM33 基因T1位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 以上測(cè)序圖箭頭所示AA型.AG型.GG型

三、蒙古族哮喘與健康蒙族人群比較

蒙古族哮喘組與健康蒙古族組的ADAM33 基因T1位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、健康蒙古族與健康漢族人群比較

表2 蒙古族哮喘與健康蒙族人群ADAM33基因T1位點(diǎn)基因型分布頻率和等位基因頻率比較[n(%)]

T1基因型及等位基因健康蒙古族(n=108)蒙古族哮喘(n=105)χ2POR95%CIAA80(74.07)94(89.52)1AG26(24.07)9(8.57)0.2950.130-0.665GG2(1.85)2(1.91)9.3430.0090.8510.117-6.180A186(84.93)197(93.81)G33(15.07)13(6.19)8.8270.0030.3720.190-0.729

表3 健康蒙古族與健康漢族人群ADAM33基因T1位點(diǎn)基因型分布頻率和等位基因頻率比較[n(%)]

T1基因型及等位基因健康蒙古族(n=108)健康漢族(n=110)χ2PAA80(74.07)79(71.82)AG26(24.07)29(26.36)GG2(1.85)2(1.82)0.1520.927A186(84.93)187(85.00)G33(15.07)33(15.00)0.0000.984

健康蒙古族與健康漢族人群各等位基因及基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

五、漢族哮喘與蒙古族哮喘患者比較

蒙古族與漢族哮喘人群各等位基因及基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

ADAM33的mRNA表達(dá)具有一定的組織特異性，主要表達(dá)于肺的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，它可能與小氣道重塑、高反應(yīng)性及炎癥等有關(guān)[3]。由于人類ADAM33基因的多態(tài)性、研究對(duì)象的人種、民族和地區(qū)差別以及實(shí)驗(yàn)方法不同等原因，國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道不盡相同。

表4 漢族哮喘與蒙古族哮喘人群ADAM33基因T1位點(diǎn)基因型分布頻率和等位基因頻率比較[n(%)]

T1基因型及等位基因蒙古族哮喘(n=105)漢族哮喘(n=112)χ2PAA94(89.52)104(92.85)AG9(8.57)7(6.25)GG2(1.91)1(0.9)0.8630.649A197(93.81)215(95.98)G13(6.19)9(4.02)1.0630.302

最先發(fā)現(xiàn)哮喘與ADAM33基因T1位點(diǎn)具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)的是Van Eerdewegh[4]等，隨后Young Ho Lee等在對(duì)亞洲人群ADAM33基因多態(tài)性進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)T1位點(diǎn)與哮喘有關(guān)[5]。我國(guó)學(xué)者邱玉明[6]、Chiang[7]等發(fā)現(xiàn)T1 位點(diǎn)基因型頻率及等位基因分別在哮喘組和對(duì)照組中比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但Schedel和Werrner等[8-9]在德國(guó)人群中卻未發(fā)現(xiàn)T1位點(diǎn)與哮喘相關(guān)。我國(guó)皖南地區(qū)、廣州市兒童中也未發(fā)現(xiàn) T1與哮喘有相關(guān)性[10-11]。目前在我國(guó)少數(shù)民族中，對(duì)新疆維吾爾族[12]及廣西壯族哮喘人群有所研究，發(fā)現(xiàn)哮喘均與T1的多態(tài)性相關(guān)，故不排除ADAM33基因多態(tài)性與地區(qū)、民族的差異有關(guān)，故本課題通過對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙、漢族人群進(jìn)行ADAM33 T1基因型、等位基因分析，進(jìn)一步闡述其與哮喘的相關(guān)性。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)首次對(duì)我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)漢族、蒙古族哮喘人群的ADAM33 基因T1位點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)比研究，對(duì)蒙、漢民族病例組和對(duì)照組T1位點(diǎn)的基因型和等位基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)漢族與蒙古族健康人群及哮喘人群分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，及民族間無差異。但證實(shí)了ADAM33基因T1位點(diǎn)多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族、漢族支氣管哮喘的發(fā)病率均具有相關(guān)性。對(duì)于T1位點(diǎn)，AA 為野生型、AG 為突變雜合子、GG 為突變純合子，在漢族哮喘組分布為104(92.85%)、7(6.25%)、1(0.9%), 在對(duì)照組分布為79(71.82%)、29(26.36%)、2(1.82%), χ2=17.176,P<0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。漢族哮喘組ADAM33 基因T1位點(diǎn)等位基因A和G 的頻率分別為95.98%、4.02%; 對(duì)照組ADAM33 基因T1位點(diǎn)等位基因A 和G 分別為85%、15%。漢族哮喘組與對(duì)照組等位基因頻率比較差異有顯著性(χ2=15.630,P<0.05) 。在蒙古族哮喘組AA、AG及GG3種基因型分布為94(89.52%) 、9(8.57%) 、2(1.91%) , 在對(duì)照組分布為80(74.07%)、26(24.07%)、2(1.85%),χ2=9.343,P<0.01, 差異有顯著性。蒙古族哮喘組ADAM33 基因T1位點(diǎn)等位基因A和G 的頻率分別為93.81%、6.19%; 對(duì)照組ADAM33 基因T1位點(diǎn)等位基因A 和G的頻率分別為84.93%、15.07%。蒙古族哮喘組與對(duì)照組A 及G 等位基因頻率比較差異有顯著性(χ2=8.827,P<0.05) 。漢族哮喘組AG、GG基因型OR值分別為0.183、 0.38，蒙古族哮喘組AG、GG基因型OR值分別為0.295、0.851；蒙、漢族支氣管哮喘組，G等位基因OR值及95%可信區(qū)間分別為0.372(0.190-0.729)、0.23(0.111-0.509)，可見內(nèi)蒙古地區(qū)蒙、漢族哮喘患者T1位點(diǎn)的基因型及等位基因多態(tài)性與哮喘發(fā)病相關(guān)，等位基因A可能為哮喘風(fēng)險(xiǎn)基因，等位基因G可能為保護(hù)基因。本實(shí)驗(yàn)與國(guó)外很多學(xué)者及我國(guó)廣西壯族、臺(tái)灣地區(qū)等研究結(jié)果一致，但也與部分研究結(jié)果不同，考慮雖與地域、民族、種族差異有關(guān)，但不排除與所選樣本不同、檢測(cè)方法不同所引起，需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

綜上所述, ADAM33 基因 T1位點(diǎn)多態(tài)性存在于內(nèi)蒙古地區(qū)人群中，ADAM33 基因T1位點(diǎn)可能在中國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族、漢族哮喘人群中發(fā)揮作用。

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Association between polymorphism of T1 locus allele in ADAM33 gene and bronchial asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population

ZHUShu-fen,NARENGao-wa

DepartmentofICU,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430071,China

Objective To explore the association of the polymorphism of T1 locus allele (rs2280091) in recombinant A disintegrin and metalloprotease 33 ADAM33 gene with bronchial asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population. Methods 112 screened Han population patients with asthma (the asthma group A) and 110 unrelated healthy Han population (the healthy control group A) were selected. 105 screened Mongolian population patients with asthma (the asthma group B) and 108 unrelated healthy Mongolian population (the healthy control group B) were selected. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used to determine polymorphism of T1 locus allele in ADAM33 gene in all groups. Results Three genotypes (AA, AG and GG) were found in Inner Mongolia Han and Mongolian population. The differences of distribution frequency in the Mongolia, Han bronchial asthma groups were significant while compared with the control group (P<0.05). The OR value of AG and GG genotype was 0.183 and 0.38 in the asthma group A, and 0.295 and 0.851 in the asthma group B. There were significant differences in T1 gene frequency loci alleles A and G between the bronchial asthma groups and the control group (P<0.05). The OR value and the 95% confidence of G allele interval was 0.372 (0.190-0.729) in the asthma group B, and 0.237 (0.111-0.509) in the asthma group A. Conclusion T1 ADAM33 gene locus gene polymorphism is associated with asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population.

ADAM33; asthma; gene polymorphism; polymerase chain restriction fragment length polymorphism; Mongolian nationality; Han nationality

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.01.018

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(No 2014MS08122)

1. 010050 內(nèi)蒙古 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

2. 010050 內(nèi)蒙古 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)

2016-06-20]