賈金海，何英輝，李 勇，李紅蕖，彭子衡，張曉琳*

(1.河北醫(yī)科大學門診部，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室，河北 石家莊 050017)

·論著·

應用γH2AX評估消炎痛對胃癌SGC-7901細胞DNA損傷的影響

賈金海1，何英輝1，李 勇2，李紅蕖1，彭子衡3，張曉琳3*

(1.河北醫(yī)科大學門診部，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室，河北 石家莊 050017)

目的以磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX,γH2AX)為檢測指標，觀察分析非甾體類抗炎藥物消炎痛對體外胃癌SGC-7901細胞DNA損傷的影響。方法分別選用消炎痛終濃度為0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L的培養(yǎng)液孵育體外培養(yǎng)的SGC-7901胃癌細胞，孵育時間均設置為0 h、12 h、24 h和48 h，處理結(jié)束，再采用免疫熒光技術觀察得到各組SGC-7901細胞的平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細胞率，采用Western-Blotting技術檢測各組SGC-7901細胞的γH2AX蛋白水平。結(jié)果不同組細胞的平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細胞率均呈先升高后降低趨勢，其組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。γH2AX蛋白水平亦呈先升后降趨勢，24 h組SGC-7901細胞γH2AX蛋白水平最高，與其他各時間組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論以γH2AX作為標志物，評估化學藥物對腫瘤細胞損傷的研究思路具有可行性和可操作性。

胃腫瘤；非甾體類抗炎藥； DNA斷裂，雙鏈

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.021

多項流行病學調(diào)查顯示，胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率排在所有惡性腫瘤的第4位，胃癌病死率更是位列全球癌癥死亡譜的第2位[1-2]。目前，胃癌治療的主要手段仍是以外科手術輔以化學藥物治療。近年來的研究表明，非甾體類抗炎藥不僅能明顯降低胃腸道腫瘤的發(fā)生風險，還具有明顯的抑制腫瘤生長作用[3]，其機制可能與抑制胃癌細胞DNA損傷修復有關[4]。磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX,γH2AX)是檢測DNA雙鏈斷裂存在的“金標準”，一個γH2AX焦點就代表著一處DNA雙鏈斷裂，γH2AX的焦點數(shù)越多，表明細胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂越多[5-6]。本研究以γH2AX為檢測指標，探討非甾體類代表性藥物消炎痛對體外胃癌細胞DNA損傷的影響。

1 資 料 與 方 法

1.1主要實驗材料、試劑及設備 胃癌細胞SGC-7901購自中國科學院上海生命科學研究院，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，小鼠抗人γH2AX單克隆抗體、小鼠抗人β-actin單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG抗體為北京中山生物技術有限公司產(chǎn)品，消炎痛為北京東亞生物制品研究所產(chǎn)品，F(xiàn)V1000激光共聚焦掃描顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.2細胞培養(yǎng)和實驗分組 選用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μmol/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基復蘇傳代后，接種于100 mL培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，加入消炎痛處理，并使各實驗組培養(yǎng)液終濃度分別達0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L，分別于繼續(xù)孵育至12 h、24 h、48 h時，收集細胞用于實驗。每組實驗重復3次。

1.3激光共聚焦掃描顯微鏡檢測γH2AX焦點 應用倒置生物顯微鏡計數(shù)SGC-7901胃癌細胞，并將細胞濃度調(diào)整至1×107個/mL，然后按照每孔2 mL的體積，接種SGC-7901細胞至已放有蓋玻片的6孔板中，選用含有不同濃度消炎痛藥物的培養(yǎng)液孵育細胞，待各組干預結(jié)束，用4%多聚甲醛冰上固定細胞30 min，PBS溶液洗滌，0.2% Triton-X 100破膜15 min，PBS溶液洗滌細胞3次，5 min/次，山羊血清工作液37 ℃封閉細胞1.5 h，一抗4 ℃孵育細胞過夜，熒光二抗孵育細胞1 h，DAPI室溫避光孵育細胞10 min，待其自然涼干，加入抗淬滅劑，用激光共聚焦掃描顯微鏡計數(shù)細胞，每組至少計數(shù)100個細胞，之后用Image Pro Plus軟件計算各組平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細胞率。平均γH2AX焦點數(shù)=γH2AX焦點總數(shù)/細胞總數(shù)，γH2AX焦點細胞率=含γH2AX焦點的細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4Western-Blotting技術檢測γH2AX蛋白 應用倒置生物顯微鏡計數(shù)SGC-7901胃癌細胞，并將細胞濃度調(diào)整1×107個/L，按照每瓶4 mL的體積，接種各組SGC-7901細胞于培養(yǎng)瓶中，待處理因素干預結(jié)束，棄掉培養(yǎng)液，預冷的PBS溶液漂洗細胞3次，每次5 min，細胞刷刮取細胞，然后將細胞溶液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，4 ℃、1 000 g條件離心細胞溶液3 min，棄上清，每管加入裂解液A溶液1 mL(用前加PMSF，終濃度為1 mmol/L)，渦旋振蕩15 s，冰浴15 min，每管加入NP-40溶液6 μL，振蕩混勻，4 ℃、12 000 g條件離心5 min，棄盡上清，每管再加入裂解液B溶液0.1 mL(用前加PMSF，終濃度1 mmol/L)，渦旋振蕩15 s，冰浴20 min，4 ℃、12 000 g條件離心20 min，上清液即為核蛋白提取液。采用Lowry法定量蛋白質(zhì)，然后進行15%的SDS-PAGE凝膠電泳，4 ℃、80 V條件濕轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜(NC膜)1 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，小鼠抗人γH2AX單克隆抗體孵育細胞2 h，Tween-PBS溶液(PBS溶液中加入0.05%Tween-20)洗膜3次，辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG抗體孵育細胞1 h，Tween-PBS溶液洗膜3次，最后，采用ECL化學發(fā)光法顯影、定影，應用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描計算各組灰度值，內(nèi)參蛋白選用β-actin。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用F檢驗、SNK-q檢驗和重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1平均γH2AX焦點數(shù)比較 各時點平均γH2AX焦點數(shù)均呈先升高后降低趨勢，其組間、時點間、組間·時點間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2γH2AX焦點細胞率比較 各時點γH2AX焦點細胞率均呈先升后降趨勢，其組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 不同濃度組各時間點平均γH2AX焦點數(shù)比較 個)

表2不同濃度組各時間點γH2AX焦點細胞率比較

組別0h12h24h48h 0μmol/L 24.61±2.4424.31±3.8525.90±1.2223.84±3.06200μmol/L 24.31±3.8535.93±1.0446.55±2.6737.26±1.38400μmol/L 25.90±1.2247.47±1.8875.89±2.4852.62±2.12600μmol/L 23.84±3.0642.46±3.2158.21±2.8947.72±2.10組間 F=261.152 P=0.000時點間 F=220.218 P=0.000組間·時點間F=39.321 P=0.000

2.3不同組γH2AX蛋白水平比較 不同時間組γH2AX蛋白水平呈先升高后降低趨勢，0 h組低于12 h組、2 4h組和48h組(P<0.05)，12 h組低于24h組、48h組(P<0.05)，48 h組與24 h組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3不同時間γH2AX蛋白水平比較

組別γH2AX蛋白0h9.620±1.81212h17.570±2.070*24h37.577±2.724*#48h33.687±2.152*#F106.979P0.000

*P<0.05與0 h比較 #P<0.05與12 h比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

DNA損傷有多種形式，包括DNA單鏈斷裂、DNA與DNA的交聯(lián)、DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、DNA雙鏈斷裂等，其中，雙鏈斷裂是DNA損傷中最為嚴重的形式，會影響DNA的雙螺旋結(jié)構，導致DNA遺傳物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，具體表現(xiàn)為染色體重排或染色體缺失，雙鏈斷裂若得不到及時修復，最終會導致細胞的增殖抑制直至凋亡[7]。研究表明，外部環(huán)境和生物體自身因素，如電離輻射、遺傳毒性化學物質(zhì)、化療藥物等，均可以誘發(fā)雙鏈斷裂的發(fā)生[8]。真核細胞DNA是與組蛋白以核小體的形式存在于細胞核內(nèi)，組蛋白主要包括H1、H2A、H2B、H3和H4五種。組蛋白H2AX是組蛋白H2A的一個亞型，其羧基末端有一段高度保守的絲氨酸-谷胺酰胺-谷氨酸結(jié)構域，該結(jié)構域中的139位絲氨酸可以被磷脂酰肌醇-3-激酶家族的成員如毛細血管共濟失調(diào)突變基因、DNA依賴性蛋白激酶等磷酸化。雙鏈斷裂發(fā)生后，被DNA損傷感應因子識別，感應因子磷酸化毛細血管共濟失調(diào)突變基因，磷酸化的毛細血管共濟突變基因又磷酸化雙鏈斷裂處的組蛋白H2AX上述結(jié)構域中的139位絲氨酸，從而形成磷酸化組蛋白H2AX，即γH2AX[9-10]。γH2AX可以從雙鏈斷裂處向兩端擴散，形成可以通過免疫標記并在熒光顯微鏡下觀察到的γH2AX焦點。γH2AX焦點與雙鏈斷裂在數(shù)量上存在一一對應關系，在真核細胞的整個周期中均可檢測到，γH2AX分析技術已成為檢測雙鏈斷裂的金標準[11-13]。

消炎痛，又名吲哚美辛，是非甾體類抗炎藥的代表性藥物，流行病學、動物模型和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，長期使用非甾體類抗炎藥對消化道腫瘤有抑制作用[14-15]。本研究以γH2AX為檢測指標，觀察消炎痛與胃癌SGC-7901細胞雙鏈斷裂的關系，結(jié)果顯示隨培養(yǎng)液中消炎痛濃度增加，SGC-7901細胞平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細胞率均呈升高趨勢，至400 μmol/L時，平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細胞率達到最高值，顯著高于200 μmol/L組(P<0.05)和600 μmol/L組(P<0.05)；同時，隨消炎痛溶液孵育時間延長，SGC-7901細胞平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細胞率亦均呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢，以孵育24 h組為最高，顯著高于12 h組(P<0.05)和48 h組(P<0.05)。表明消炎痛作用于胃癌SGC-7901細胞，致其細胞核中γH2AX焦點變化的效應具有濃度依賴性和時間依賴性。此外，析因方差分析結(jié)果還表明，消炎痛致SGC-7901細胞γH2AX焦點變化的作用濃度和作用時間具有顯著的協(xié)同效應(P<0.05)。

免疫熒光結(jié)果確定了消炎痛作用于胃癌SGC-7901細胞的最佳濃度是400 μmol/L，最佳時間是24 h。在此條件下，本研究進行了Western-Blotting實驗，觀察了經(jīng)含消炎痛培養(yǎng)液孵育后，胃癌SGC-7901細胞γH2AX蛋白的表達水平變化，結(jié)果顯示 隨作用時間延長，γH2AX蛋白相對表達水平呈先升后降趨勢，24 h組的蛋白水平明顯高于其他各組(P<0.05)。表明了消炎痛對胃癌SGC-7901細胞γH2AX變化的影響。

γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標志，與雙鏈斷裂數(shù)量呈1∶1關系，能夠快速而敏感地反映DNA的受損情況[16]。本研究以γH2AX為檢測指標，間接評估了非甾體類抗炎藥物消炎痛對胃癌SGC-7901細胞DNA損傷的影響，結(jié)果顯示以γH2AX作為標志物，評估化學藥物對腫瘤細胞損傷的研究思路具有可行性和可操作性。

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2017-06-16；

2017-07-24

河北省高等學?？茖W研究項目(Z2012079)

賈金海(1976-)，男，河北曲周人，河北醫(yī)科大學門診部副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事消化系統(tǒng)疾病診治研究。

*通訊作者

R735.2

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1007-3205(2017)12-1448-03

劉斯靜)