□ 蔣妍妮 吉安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 黃小流 戴彩華 井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部

不同地域馬齒莧多糖的總糖測(cè)定及抗氧化活性比較研究

□ 蔣妍妮 吉安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 黃小流 戴彩華 井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部

本文旨在探討不同地域馬齒莧多糖體外抗氧化活性及測(cè)定其總糖含量。方法：苯酚-硫酸比色法測(cè)定馬齒莧多糖的總糖含量，分別采用Fenton法、DPPH法和FRAP法研究馬齒莧多糖體外抗氧化活性。結(jié)果：內(nèi)蒙古、安徽與河南的馬齒莧多糖的總糖含量分別為14.69%，31.54%，38.17%；對(duì)羥自由基與DPPH自由基清除能力為內(nèi)蒙古＞河南＞安徽，對(duì)Fe3+的還原力為河南＞內(nèi)蒙古＞安徽。結(jié)論：馬齒莧多糖有良好的體外抗氧化活性，多糖含量及體外抗氧化有地域性差異。

不同地域；馬齒莧多糖；總糖含量；體外抗氧化活性

馬齒莧（Portulaca oleracea L）為馬齒莧科植物全草，又名長(zhǎng)壽菜、螞蚱菜、馬舌菜等，可入藥，也可食用；馬齒莧是已在民間有較早應(yīng)用歷史的傳統(tǒng)中藥，目前是衛(wèi)生部劃定的78種藥食兩用野生資源之一?！侗静菥V目》與《滇南本草》分別記載，馬齒莧有“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產(chǎn)后虛汗”，“清熱利濕，消炎解毒，消腫止痛”等功效；現(xiàn)代藥理及營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究馬齒莧有降血脂、降血糖，抗菌、抗病毒，松弛肌肉，保護(hù)血管、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤等藥理活性，同時(shí)還有良好抗氧化、延緩衰老等營(yíng)養(yǎng)保健作用。

有機(jī)酸、黃酮類、生物堿類、多糖、氨基酸和礦物質(zhì)等是馬齒莧的主要化學(xué)成分。多糖稱為多聚糖（polysaccharide），結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，它不僅是儲(chǔ)存能量的物質(zhì)，同時(shí)具有重要生物學(xué)活性如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性、降血糖血脂等，目前已有香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖、黃氏多糖和豬苓多糖等應(yīng)用于臨床。當(dāng)前對(duì)于馬齒莧多糖活性的研究已有報(bào)道，吳榮昆[1]采用Fenton、DPPH及FRAP法研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖有一定的體外抗氧化活性。植物體內(nèi)糖類物質(zhì)蓄積可受氣候或生態(tài)環(huán)境影響，不同地域的馬齒莧多糖水平在同一收獲期內(nèi)是否會(huì)有差異，其體外抗氧化活性有無差別有待進(jìn)一步探討，為馬齒莧資源藥食開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑

馬齒莧全草分別采自內(nèi)蒙古（赤峰）、河南（洛陽(yáng)）和安徽（安慶）（2014年7月，自然曬干），經(jīng)井岡山大學(xué)生命科學(xué)院許東風(fēng)教授鑒定為馬齒覓（Portulaca oleracea L）；DPPH（二苯代苦味肼基自由基，上海源葉生物科技有限公司）；TPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪，上海源葉生物科技有限公司）；D-無水葡萄糖（≥ 98%，索萊寶公司）；硫酸亞鐵、無水乙醇、氯化鐵、水楊酸、鹽酸、丙酮、石油醚、過氧化氫、冰醋酸、無水乙醚、三水合醋酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

LS5紫外-可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、DU215CD電子分析天平（奧豪斯）、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、SHB-IIIA 循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）、DG160C粉碎機(jī)（浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠）、GRQ-05A干熱消毒箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 馬齒莧多糖的提取

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件及參考朱曉宦等試驗(yàn)方法，馬齒莧干料粉碎后過40目篩，脫脂，按以下條件進(jìn)行水提：料液比（1∶15，m/v）、溫度100 ℃、30 min/次（熱水浴回流，共4次），冷卻過濾，合并濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約50 mL。濃縮液分次加入95%乙醇、80%乙醇進(jìn)行層析，得到沉淀物后依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌后干燥備用。

2.2 馬齒莧多糖的總糖測(cè)定

精確稱量一定質(zhì)量D-無水葡萄糖溶于重蒸餾水，定容配制成初始液，然后稀釋成不同質(zhì)量濃度倍數(shù)待測(cè)，采用苯酚-硫酸比色法，測(cè)得各濃度值對(duì)應(yīng)的吸光值，擬合方程制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 羥自由基清除率

采用Fenton法[2]：取4mL Fenton工作液和2 mL待測(cè)液混勻，避光靜置10 min，離心；取上清液4 mL，加入2 mL 6 mmol/L水楊酸充分混勻，避光靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值。羥自由基清除率=1-(A0-A1)/A2×100%，A0為不同濃度樣品的吸光值，A1為用蒸餾水替代水楊酸時(shí)測(cè)得對(duì)應(yīng)濃度樣品的吸光值，A2為蒸餾水替代樣品時(shí)測(cè)得空白對(duì)照吸光值。

2.4 DPPH自由基清除率[3]

取5 mL 1.141×10-4mol/L DPPH工作液（70%乙醇為溶劑）和0.5 mL不同濃度的樣品液混合均勻，避光靜置30 min，于523 nm處測(cè)定吸光值。DPPH自由基清除率=(1-A/A0)×100%，A為樣品吸光值，A0為對(duì)照樣吸光值。

2.5 還原力

采用FRAP法[4]：取0.3 mL不同濃度樣品和2.7 mL預(yù)熱至37 ℃的FRAP工作液混合均勻，避光靜置30 min，于593 nm處測(cè)定吸光值。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取12.16 mg硫酸亞鐵溶于適量的水中，加入18 mol/L硫酸0.50 mL，再加蒸餾水稀釋至100 mL定容，并投入小鐵釘。取上述溶液依次分別配制4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行線性及二次曲線擬合，得相關(guān)方程計(jì)算相應(yīng)數(shù)據(jù)并分析。

3 結(jié)果

3.1 馬齒莧多糖的總糖含量

依照2.2的方法，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.4403x-0.0461（R2=0.995），計(jì)算得出內(nèi)蒙古、安徽和河南馬齒莧多糖的總糖含量分別為14.69%、31.54%和38.17%。由結(jié)果可知，河南與安徽馬齒莧多糖含量分別約是內(nèi)蒙古的2.60倍、2.15倍，表明河南與安徽馬齒莧多糖的總糖含量比較接近，內(nèi)蒙古總糖含量明顯低于河南與安徽的。

3.2 馬齒莧多糖清除羥自由基的能力

由圖1可見，馬齒莧多糖對(duì)羥自由基有清除作用，隨著濃度增加，清除率也增加，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過對(duì)其效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行二次曲線方程擬合，根據(jù)對(duì)應(yīng)擬合方程計(jì)算SC50值；從表1結(jié)果可見：內(nèi)蒙古、安徽和河南三地馬齒莧多糖對(duì)羥自由基清除能力為內(nèi)蒙古＞河南＞安徽，其中安徽對(duì)應(yīng)SC50值分別約是內(nèi)蒙古與河南的1.42倍和1.26倍，河南是內(nèi)蒙古的1.12倍，表明三地馬齒莧多糖對(duì)羥自由基清除能力有較大差異。

圖1 馬齒莧多糖對(duì)羥自由基的清除率與濃度關(guān)系曲線

3.3 馬齒莧多糖清除DPPH自由基的能力

由圖2可見，馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基有清除作用，隨著濃度增加，清除率也增加，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過對(duì)其效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行二次曲線方程擬合，根據(jù)對(duì)應(yīng)擬合方程計(jì)算SC50值；從表2結(jié)果可見：內(nèi)蒙古、安徽和河南三地馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基清除能力為內(nèi)蒙古＞河南＞安徽，其中安徽對(duì)應(yīng)SC50值分別約是內(nèi)蒙古與河南的1.05倍和1.02倍，三者的值相差較小，表明三地馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基清除能力比較接近。

圖2 馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基的清除率與濃度關(guān)系曲線

表1 馬齒莧多糖對(duì)羥自由基清除的SC50值

表2 馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基清除的SC50值

3.4 馬齒莧多糖還原鐵離子的能力

依照2.5的實(shí)驗(yàn)方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和結(jié)果見圖3、圖4、圖5和圖6。

從圖4可見，F(xiàn)e2+在593 nm處吸光值與其在62.5～4000 μmol/L濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，線性方程為y=0.0003x+0.0094（R2=0.9972）。

圖3 硫酸亞鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 內(nèi)蒙古馬齒莧多糖還原力的FRAP值與濃度的關(guān)系線性圖

圖5 安徽馬齒莧多糖還原力的FRAP值與濃度的關(guān)系線性圖

由圖5、6、7結(jié)果綜合可見，不同地域馬齒莧多糖都有把Fe3+還原成Fe2+能力，還原力與對(duì)應(yīng)的濃度成線性關(guān)系。通過對(duì)其效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行線方程擬合，根據(jù)對(duì)應(yīng)擬合方程計(jì)算FRAP1000值；從表3數(shù)據(jù)顯示，不同地域馬齒莧多糖對(duì)Fe3+的還原能力為河南＞內(nèi)蒙古＞安徽，其中安徽對(duì)應(yīng)FRAP1000值分別約是內(nèi)蒙古與河南的1.05倍和1.07 倍，三者的值相差較小，表明三地馬齒莧多糖對(duì)Fe3+還原能力比較接近。

4 討論

馬齒莧是一年生肉質(zhì)草本，性喜高濕、向陽(yáng)、耐旱、耐澇，我國(guó)南北各地均常見。馬齒莧分布廣泛主要與其對(duì)土壤因子如有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮、全鉀、銨態(tài)氮、速效鉀的適應(yīng)范圍較寬有關(guān)，土壤因子如全磷和全氮還對(duì)馬齒莧葉、莖的鮮重，植株?duì)I養(yǎng)物總糖、蛋白質(zhì)水平影響顯著；植株的總糖、黃酮含量與采摘月份有關(guān)，需提取總糖建議最佳采收期為8月中旬[15]。曲曉蘭[16]分析采自泰山不同月份野生馬齒莧多糖含量為9月上旬最高，陳凌[17]分析嘉興馬齒莧結(jié)果為8月＞7月＞9月，這暗示馬齒莧多糖水平有地域上差異。本研究結(jié)果可見同為7月中旬采收來自內(nèi)蒙古（赤峰）、安徽（安慶）和河南（洛陽(yáng)）馬齒莧多糖含量分別為14.69%、31.54%和38.17%。以上差異我們推測(cè)可能是安徽與河南地域比較靠近，內(nèi)蒙古與上述2地相距較遠(yuǎn)，馬齒莧生長(zhǎng)的土壤因子，氣候條件，光照強(qiáng)度等差別大導(dǎo)致。李香和劉躍鈞分別測(cè)定貴州4地（平塘、龍里、獨(dú)山和都勻），浙江麗水6地（縉云縣、蓮都區(qū)、龍泉市、青田縣、松陽(yáng)縣和云和縣）馬齒莧多糖總量水平較接近的結(jié)果有可能是與采集地域比較接近有關(guān)[18-19]。

目前常用抗氧化活性檢測(cè)方法主要基于3個(gè)方面機(jī)理，一是對(duì)反應(yīng)體系中脂質(zhì)氧化物抑制能力，二是對(duì)反應(yīng)體系中自由基清除能力，三是對(duì)反應(yīng)體系中目標(biāo)氧化物的還原能力[20]。為了探究來自不同地域馬齒莧多糖體外抗氧化能力及與其含量水平是否有關(guān)，我們采用Fenton、DPPH和FRAP三種方法來評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，羥自由基是一種能激發(fā)油脂過氧化的較強(qiáng)氧化劑，F(xiàn)enton工作液為水溶性自由基體系；DPPH法有快捷、簡(jiǎn)便和靈敏優(yōu)點(diǎn)，為脂溶性自由基體系；FRAP原理是基于氧化還原反應(yīng)的比色法，有快速、簡(jiǎn)便和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，SC50和FRAP1000分別為評(píng)價(jià)清除自由基能力與鐵離子還原能力指標(biāo)。由結(jié)果可知，內(nèi)蒙古馬齒莧多糖對(duì)羥自由基和DPPH自由基清除率能力最強(qiáng)，安徽的最弱；從對(duì)鐵離子還原力來看，河南馬齒莧多糖能力最高，安徽的最低；綜合來看三地馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基清除率、鐵離子還原力比較接近；對(duì)羥自由基的清除率有較大差別。從馬齒莧多糖含量與抗氧化活性關(guān)系可見，河南與安徽兩地馬齒莧多糖抗氧化活性與含量出現(xiàn)一致性結(jié)果，而內(nèi)蒙古馬齒莧多糖含量最低，其抗氧化能力最佳，這暗示地域相距遠(yuǎn)馬齒莧的內(nèi)在特性差異更大。由此我們推測(cè)不同地域尤其是相距遠(yuǎn)的地域馬齒莧由于受不同地理環(huán)境，氣候條件等影響，其內(nèi)在的化學(xué)物在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、種類等不同而表現(xiàn)出外在營(yíng)養(yǎng)活性不一樣。

圖6 河南馬齒莧多糖還原力的FRAP值與濃度的關(guān)系線性圖

表3 樣品FRAP1000值與濃度關(guān)系

總之，本研究通過分析比較三個(gè)地域馬齒莧多糖含量及其體外抗氧化能力，結(jié)果表明不同地域馬齒莧多糖含量及抗氧化活性有差異，地域相距越遠(yuǎn)，馬齒莧以上特性差異性越大，具體的相關(guān)性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[1]丁懷偉,姚佳琪,宋少江.馬齒莧的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2008(10):831-838.

[2]朱麗,徐為公,趙廣榮.馬齒莧的研究現(xiàn)狀與綜合開發(fā)利用[J].河北林果研究,2006(2):198-201.

[3]牛廣財(cái),朱丹.馬齒莧化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(6):1090-1092.

[4]陳國(guó)妮.馬齒莧黃酮類化合物的提取及抗菌特性研究[D].西安:西安工程大學(xué),2016.

[5]孔瑩.馬齒莧化學(xué)成分研究[D].長(zhǎng)春:東北師范大學(xué),2014.

[6]梁彥,呂艷榮.馬齒莧多糖的抗衰老作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科技,2014(4):270-272.

[7]鞠興榮,施洪飛.馬齒莧抗氧化作用實(shí)驗(yàn)研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2000(6):466-467.

[8]潘姝.馬齒莧中多糖和黃酮的分離純化及其抑菌作用的研究[D].長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[9]李碧嬋.多糖的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)西部科技,2008(22):31-40.

[10]林俊,李萍,陳靠山.近5年多糖抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2013(8):1116-1125.

[11]吳榮昆,黃小流,劉美金,等.井岡山馬齒莧多糖的體外抗氧化作用及總糖含量測(cè)定[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2016(2):102-106.

[12]趙莉,高長(zhǎng)健,王剛,等.不同氣候環(huán)境對(duì)烏頭粗多糖含量的影響[J].綿陽(yáng)師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2000(5):49-51.

[13]趙莉.產(chǎn)地及栽培條件對(duì)甘草多糖和甘草酸含量的影響[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[14]朱曉宦,吳向陽(yáng),仰榴青,等.馬齒莧粗多糖的提取及清除羥自由基活性作用[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2007(1):57-60.

[15]趙紅.馬齒莧（Portulaca oleracea L.）的生態(tài)適應(yīng)性及南北種源萌發(fā)差異研究[D].重慶:西南大學(xué),2010.

[16]曲曉蘭,蘇延友,高紅莉,等.馬齒莧不同采收期多糖含量的測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2006(10):1960-1961.

[17]陳凌,賀偉強(qiáng),陶昆,等.不同采收期馬齒莧活性成分含量及抗氧化性的變化[J].北方園藝,2015(8):157-160.

[18]李香,彭小冰,汪云偉,等.黔產(chǎn)馬齒莧多糖的含量測(cè)定[J].貴州科學(xué),2012(5):27-29.

[19]劉躍鈞,葛永金,蔣燕鋒,等.浙江麗水不同產(chǎn)地馬齒莧多糖含量測(cè)定與比較[J].南方林業(yè)科學(xué),2015(2):10-19.

[20]劉志東,郭本恒,王蔭榆.抗氧化活性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008(20):563-567.

吉安市科技支撐項(xiàng)目（吉安科計(jì)字[2013]18號(hào)4）。

蔣妍妮（1977—），女，江西吉安人，本科，主管藥師。研究方向：食品、藥品檢驗(yàn)檢測(cè)。