葉翠萍 王文倩 曹 赟 趙明明 曾 勇 古 銳

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

實(shí)驗(yàn)研究

△江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項(xiàng)目(JXXT201402008-1)；

△國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目：基于分子古生物學(xué)的藏藥渣馴形成機(jī)制研究(83571699)。

藏藥渣馴正丁醇部位對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用△

葉翠萍 王文倩 曹 赟 趙明明 曾 勇 古 銳*

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

目的：研究渣馴正丁醇部位對(duì)對(duì)乙酰氨基酚(APAP)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法小鼠腹腔注射250mg·kg-1APAP制備急性肝損傷模型，檢測小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性；測定肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量；并做肝臟組織病理學(xué)檢查。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠ALT、AST、MDA含量明顯升高，SOD活性降低(P<0.01)，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的變性壞死；與模型組比較，渣馴正丁醇部位中、高劑量組能夠降低急性肝損傷小鼠ALT、AST和MDA的含量，提高SOD的活性(P<0.05)。結(jié)論渣馴正丁醇部位中、高劑量組對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

渣馴;對(duì)乙酰氨基酚;急性肝損傷;保護(hù)作用

傳統(tǒng)藏藥渣馴，藏語發(fā)音為 Brag-zhun，藏譯音“渣”是高山及巖石的名稱， “馴” 為巖石中流出的巖汁或溶液，意譯即“巖石的精華”，簡稱“巖精”。公元8世紀(jì)的《月王藥診》中記載，“巖精能干枯膿血，主治肝病，清諸熱，誘發(fā)寒癥”[1]?！墩撜f續(xù)》中亦記載“渣馴能治療一切熱證，特別是清肝熱等”[2]。素有“肝?！焙汀案文懬濉泵婪Q[3]的藏藥渣馴，是藏醫(yī)臨床治療熱性疾病的常用藥物[4]，具有1300多年的應(yīng)用歷史。在藏醫(yī)臨床實(shí)踐中，用于肝熱病治療的“九味牛黃丸、五味渣馴丸(藏藥名：渣馴阿巴日布)”等藏成方制劑中均含有渣馴，渣馴在藏藥處方中的出現(xiàn)頻率位列第6[5]。另現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明渣馴具有抗氧化、清除自由基、抗炎、刺激機(jī)體再生等作用，對(duì)熱灼傷和四氯化碳處理的肝組織損傷再生有很好的治療效果[4,6]。渣馴具有明確的保肝作用，但發(fā)揮該作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，課題組前期進(jìn)行了渣馴及其提取物保肝作用的篩選研究，結(jié)果表明渣馴正丁醇部位對(duì)刀豆蛋白A(Con A)所致肝損傷保護(hù)作用較優(yōu)，可能是渣馴治療肝損傷的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于渣馴臨床應(yīng)用的廣泛性，本研究將探討渣馴正丁醇部位對(duì)APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷的保護(hù)作用，以期為渣馴單方制劑的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑：渣馴藥材購自四川省阿壩州馬爾康縣，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)降擁四郎主任藏醫(yī)師鑒定為正品；對(duì)乙酰氨基酚(sigma國內(nèi)分裝，用生理鹽水配制，可適當(dāng)加熱助溶)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT/GPT，批號(hào)：20160425)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST/GOT，批號(hào)：20160422)、超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)：20160502)和丙二醛(MDA，批號(hào)：20160502))試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所；冰醋酸、無水乙醇均購自于成都科龍化工試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康昆明種小鼠，雄性，體重18～22g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(川)2013-17。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，自由攝食飲水。

1.3 主要儀器：WH-3型微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3型全波長多功能讀數(shù)儀(美國Thermo公司)；CX41型正置顯微鏡(OLYMPUS公司)；TKD-TSB型組織脫水機(jī)(中國湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司)；TB-718D型石蠟包埋機(jī)(中國湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)；RM2235型石蠟切片機(jī)(中國上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；DFC295-IMS型圖像分析系統(tǒng)(中國武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 渣馴正丁醇部位的制備：按照《藏藥炮制規(guī)范2008年版》制備渣馴膏[7]，取適量正品渣馴樣品用100℃開水浸泡并過濾3次，收集濾液后用16層紗布濾過。將得到的濾液濃縮至濃稠狀態(tài)，后將濃稠液在水浴鍋中揮至流膏狀為渣馴膏。取適量渣馴膏水溶解液用正丁醇在5000mL分液漏斗中進(jìn)行萃取分離。多次萃取直到萃取層呈無色狀，得渣馴正丁醇部位。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模及給藥：取健康昆明種雄性小鼠48只，按體重分層，隨機(jī)分為6組，每組8只：正常對(duì)照組，模型組，陽性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯150mg·kg-1)，渣馴正丁醇部位低、中、高劑量組(按渣馴生藥量計(jì)，分別為167mg·kg-1、333mg·kg-1、666mg·kg-1)。各組于每日上午9點(diǎn)開始灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型組給予等體積的0.5%CMC-Na，其余各給藥組按劑量表給藥(見表1)，給藥體積均為0.02mL/g，連續(xù)給藥7d，1次/d。末次給藥1h后，除正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水外，其余各組按0.01mL/g腹腔給予250mg·kg-1APAP[8,9]制備小鼠急性肝損傷模型。

2.3 檢測指標(biāo)：造模24h后，所有動(dòng)物稱量體重后均摘眼球取血，制備血清用于ALT、AST的檢測。頸椎脫臼處死小鼠，摘取肝臟，冰生理鹽水漂洗，濾紙吸干后稱重，用于計(jì)算小鼠肝臟指數(shù)，同時(shí)肉眼觀察肝臟外觀變化；取部分肝左葉制備肝組織勻漿，用WST-1法測定肝中超氧化物歧化酶(SOD)含量；用TBA法測定肝中丙二醛(MDA)含量；另取肝大葉固定于10%的中性甲醛溶液中用于蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光鏡下觀察肝臟組織病理變化。

3 結(jié)果

3.1 渣馴正丁醇部位對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟眼觀可見明顯的壞死，腫大，肝臟指數(shù)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，渣馴正丁醇部位各給藥組肝臟指數(shù)有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表1。

表1 渣馴正丁醇部位對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響

注:與正常對(duì)照組比較，#P<0.05。

3.2 渣馴正丁醇部位對(duì)小鼠血清中ALT、AST的影響：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST活性顯著升高(P<0.01)，表明小鼠急性肝損傷模型復(fù)制成功。給予不同劑量的渣馴正丁醇部位，ALT和AST水平較模型組均有不同程度的降低，且隨著劑量的增加，下降趨勢更為明顯。其中渣馴正丁醇部位中、高劑量組ALT、AST活性下降明顯(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 渣馴正丁醇部位對(duì)小鼠血清中ALT、AST的影響

注:與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 渣馴正丁醇部位對(duì)小鼠肝組織中SOD、MDA含量的影響：與正常對(duì)照組比較，模型組SOD活性下降，MDA含量增加，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，渣馴正丁醇部位中、高劑量組SOD活性增加，MDA含量下降明顯(P<0.05)；低劑量組SOD、MDA含量有下降趨勢，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表3。

表3 渣馴正丁醇部位對(duì)小鼠肝組織中SOD、MDA的影響

注:與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.4 小鼠肝組織病理變化：由圖1可知，正常對(duì)照組，肝組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯異常。模型組可見肝臟廣泛壞死伴淤血，肝臟結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞核固縮、凋亡，匯管區(qū)見少量炎細(xì)胞浸潤；聯(lián)苯雙酯組，局部匯管區(qū)水腫伴有少量炎細(xì)胞浸潤，余未見明顯異常；渣馴正丁醇部位各劑量組，隨著劑量的增加，肝細(xì)胞壞死、變性和炎癥細(xì)胞浸潤的程度相應(yīng)減輕。

4 討論

藥物性肝損傷(drug induced liver injury，DILI)是指在應(yīng)用藥物過程中由藥物或其代謝產(chǎn)物引起的肝臟疾病[10]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種新型藥物不斷上市，臨床用藥種類逐漸增多，以及人們保健意識(shí)的不斷增強(qiáng)，DILI的發(fā)生率逐年上升并成為引發(fā)肝病的重要原因之一，并成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球死亡原因的第五位已被DILI所占據(jù)。目前已有1100多種藥物可引起DILI[11]。根據(jù)Hy′s法則[12]，死亡風(fēng)險(xiǎn)至少為10%，Ou等[13]的研究中可達(dá)12.69%。因此，研發(fā)有效的保肝藥物依然是當(dāng)今藥物研究的熱點(diǎn)和難題。

對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一種常見的解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床應(yīng)用實(shí)踐表明，大劑量或者長期服用，?？蓪?dǎo)致肝損傷等嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，APAP成為建立藥物性肝損傷模型的常用藥物，其血清學(xué)指標(biāo)ALT、AST是反應(yīng)肝實(shí)質(zhì)損害常見的主要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究中，模型組小鼠血清中ALT、AST含量均顯著增高(P<0.01)，表明模型建立成功。而各給藥組在給予不同劑量的渣馴正丁醇部位后，ALT、AST、MDA含量降低，SOD活性增加，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，以渣馴正丁醇部位中、高劑量組效果尤為顯著(P<0.05)。此外，小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，渣馴正丁醇部位3個(gè)劑量組隨著給藥劑量的增加，肝細(xì)胞壞死、變性及細(xì)胞浸潤程度相應(yīng)的降低，表明渣馴正丁醇部位對(duì)APAP所致的肝損傷有一定的保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]多吉杰傅, 和尚馬哈亞娜,比如扎那,譯.月王藥診[M].北京:民族出版社.1985: 138．

[2]宇妥·元丹貢布. 四部醫(yī)典(藏文版)[M].拉薩：西藏人民出版社,1982, 2: 66-75.

[3]索南鄧登,童麗,袁冬平,等. 傳統(tǒng)藏藥渣馴的文獻(xiàn)研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥, 2012, 21(4):8-9.

[4]木拉提·克扎衣別克. 塔斯馬依的研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志,2013, 38(3):443-447.

[5]曹赟,古銳,馬逾英,等. 藏藥“渣馴”物質(zhì)組成研究[J]. 中藥材,2015, 38(2):279-283.

[6]Vaishwanar I,Kowale C N,Jiddewar G G. Effect of two Ayurvedic drugs shilajeet & eclinol on changes in liver & serum lipids produced by carbon tetrachloride[J]. Indian J Exp Biol, 1976, 14(1):57.

[7]洛桑多吉. 藏藥炮制規(guī)范(2008年版)[M].拉薩：西藏人民出版社, 2008:114～115.

[8]陳歡,馬磊,黃茹,等. 原花青素在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015, 40(3):358-361.

[9]尹學(xué)哲,金延華,王玉嬌,等. 草蓯蓉不同溶劑萃取物對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中國藥學(xué)雜志,2014, 49(6):469-472.

[10]任美欣,孟慶華. 藥物性肝損傷[J]. 臨床薈萃,2016, 31(7):713-716.

[11]Reuben A,Koch DG,Lee WM. Drug induced acute liver failure:results of a U.S. Multicenterprospective study[J]. Heapatology,2010, 52(6): 2065-2076.

[12]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)藥物性肝病學(xué)組. 藥物性肝損傷診治指南[J]. 中華肝臟病雜志,2015, 23(11): 810-820.

[13]Ou P,Chen Y,Li B,et al. Causes,clinical features and outcomes of drug induced liver injury in hospitalized patients in a Chinese teriary care hospital[J]. Springerplus, 2015, 4: 802.

葉翠萍，女，在讀研究生，從事中藥的藥效與毒理研究；E-mail: 460323715@qq.com。

*通訊作者：古銳，男，副研究員，從事民族藥可持續(xù)開發(fā)與利用研究；E-mail: 664893924@qq.com，Tel: 15108237310。

R291.4

A

1006-6810(2017)05-0060-03

2017年1月17日收稿