尤朵 陳亞楠 楊如 許芝山 路平 鐘根深

初診肺癌患者多次化療外周血免疫相關(guān)指標動態(tài)變化的研究*

尤朵①②陳亞楠①楊如①許芝山①路平②鐘根深①

目的：探索免疫治療與化療相結(jié)合的有利切入點，為臨床免疫治療介入提供試驗依據(jù)。方法：收集2015年11月至2016年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院初診的23例肺癌患者，全部患者均完成連續(xù)5個周期的化療，采用流式細胞術(shù)方法檢測化療過程中患者外周血免疫相關(guān)指標如CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD19+B細胞和CD16+、CD56+、NK細胞比率，T細胞表面共信號分子PD-1、PD-L1、CD137、CTLA-4、CCR-4、LAG-3以及細胞因子表達情況。分析多周期過程中，上述指標動態(tài)變化趨勢。結(jié)果：在肺癌患者多個周期的化療過程中，機體CD8+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞和CD16+、CD56+、NK細胞水平下調(diào)，CD4+T淋巴細胞數(shù)量增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；T細胞表面共抑制分子PD-1、CTLA-4和CCR-4隨治療進行表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：肺癌患者在多個周期的化療中，實施淋巴細胞亞群數(shù)量及T細胞表面共抑制分子監(jiān)測具有重要意義，化療中后期針對免疫檢查點高表達患者，聯(lián)合應(yīng)用PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體或CCR-4抗體可能具有更優(yōu)的治療效果。

免疫治療 T細胞表面共信號分子 肺癌 多個周期的化療

肺癌已成為全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率居首位的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例約160萬，其總體治愈率＜20%，其中晚期患者5年生存率不到5%，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）晚期患者給予標準含鉑兩藥聯(lián)合化療，其中位總生存期（median overall survival，mOS）僅10個月［1-2］。從免疫學(xué)的角度分析，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是腫瘤細胞與免疫系統(tǒng)之間相互對抗博弈的過程［3］。隨著科學(xué)研究工作的不斷進展，免疫治療與化療的相結(jié)合也逐漸成為關(guān)注的重點。

化療或放療作用對免疫系統(tǒng)的作用很復(fù)雜：一方面提高腫瘤抗原的表達和抗原表位的增加，增強腫瘤免疫原性，通過樹突狀細胞呈遞，活化T細胞功能；另一方面通過上調(diào)腫瘤細胞表面多種抑制分子、誘導(dǎo)Treg細胞分化、表觀遺傳修飾等多種途徑抑制T細胞功能［4］?；熁蚍暖熢诖蚱颇[瘤免疫壁壘的同時，通過聯(lián)合應(yīng)用免疫治療，可在殺傷腫瘤細胞的同時，啟動機體抗腫瘤免疫，以期達到更優(yōu)的治療效果［5］。

機體內(nèi)免疫功能評價的重要指標包括免疫細胞的變化，特別是淋巴細胞、淋巴細胞總體數(shù)量及其亞群數(shù)量變化代表機體不同的免疫格局呈現(xiàn)［6］；T淋巴細胞表面存在抑制性與刺激性共信號分子，統(tǒng)籌協(xié)調(diào)T淋巴細胞功能與活性，是機體抗腫瘤免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］；細胞因子參與人體多項重要的生理病理變化，作為腫瘤與免疫環(huán)境之間的信息載體，是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分［8］。

基于化療對機體免疫功能的復(fù)雜影響，通過動態(tài)觀察肺癌患者化療過程中外周血淋巴細胞亞群、T淋巴細胞表面共信號分子、細胞因子等相關(guān)免疫指標的變化，可以藉此評價化療過程中機體免疫功能狀況變化趨勢，有助于為臨床免疫治療介入提供試驗依據(jù)，其最終目的在于為個體化免疫治療策略的制定提供可能的研究方法與理論支持。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 患者一般特征 收集2015年11月至2016年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院初診的23例肺癌患者，患者詳細臨床病理資料見表1。患者中位年齡為59（38～76）歲，13例（56.5%）患者為男性，病理類型為腺癌13例（56.5%），中晚期患者22例（95.7%），單純化療患者15例（65.2%），化療聯(lián)合其他治療方式患者8例（34.8%）。

1.1.2 主要儀器和試劑 FACSCalibur購自美國BD公司；離心機購自美國Thermo公司；Cytometric Bead Array購自美國BD公司；Human Th1/Th2/Th17A和Cytokine Kit均購自美國BD公司；anti-human CD3、anti-human CD4、anti-human CD8、anti-human CD19、anti-human CD16和anti-human CD56抗體均購自美國eBioscience公司。anti-human PD-1、anti-human PD-L1、anti-human CTLA-4、anti-human LAG-3、anti-human CCR-4和anti-human CD137抗體均購自美國Biolegend公司。

表1 入組患者臨床病理資料Table 1 Clinical and pathological data of patients enrolled in the group

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計 本研究為前瞻性臨床研究。入組標準：1）初治的經(jīng)病理學(xué)確診的肺惡性腫瘤，病理分類診斷方法參照2017年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）肺惡性腫瘤病理分類標準；2）ECOG評分≤2分；3）有客觀可測量的腫瘤病灶；4）肝、腎、骨髓功能基本正常；5）預(yù)期生存期＞3個月。排除標準：1）既往惡性腫瘤病史；2）嚴重感染性疾病、肝病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、免疫缺陷病等嚴重影響免疫功能的疾??；3）其他未控制的嚴重性內(nèi)科疾患；4）同時采用其他試用藥物或正在參與其他臨床試驗。

1.2.2 病例收集 最終統(tǒng)計分析病例共23例（31.94%），集齊連續(xù)5個周期化療前外周血液標本，其余病例失訪、中間標本缺失或截至統(tǒng)計日期前未達5個周期化療。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)員會批準，患者和其家屬均知情同意。

1.2.3 淋巴亞群分析 淋巴細胞亞群取2個流式管，分別標記A和B，各加入100 μL抗凝全血，A管加入10 μL CD3+/CD4+/CD8+/CD45+抗體，B 管加入 10 μL CD3+/CD16+/CD56+/CD19+抗體，分別混勻，室溫避光孵育20 min；各加入500 μL溶血素，混勻，室溫避光10 min，2 h內(nèi)上機檢測。

1.2.4 PD-1、PD-L1等免疫檢測分析 檢測CD4+T、CD8+T細胞中PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、CCR-4和CD137的表達水平取14個流式管，分別標記CD4+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD4+CTLA-4+、CD4+LAG-3+、CD4+CCR-4+、CD4+CD137+、CD8+、CD8+PD-1+、CD8+PD-L1+、CD8+CTLA-4+、CD8+LAG-3+、CD8+CCR-4+和 CD8+CD137+，每個管加抗凝全血100 μL，然后加入相應(yīng)標記的抗體各10μL，混勻，室溫避光孵育20min，各加入500μL溶血素，混勻，室溫避光10 min；離心棄上清，PBS洗滌一遍后重懸，2 h內(nèi)上機檢測。

1.2.5 Th1/Th2/IL17A細胞因子檢測 檢測相關(guān)細胞因子根據(jù)Cytometric Bead Array（CBA）Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit說明書提供的方法處理樣本，然后上機檢測細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-17A。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計量數(shù)據(jù)均采用表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血常規(guī)變化趨勢

5個周期化療過程中外周血白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、血小板、血紅蛋白的水平明顯較前下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.2 外周血生化指標變化

5個周期化療過程中外周血生化水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

2.3 淋巴細胞細胞亞群變化趨勢

CD8+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞和CD16+CD56+NK細胞水平下調(diào)，CD4+T淋巴細胞水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

2.4 CD4+T細胞表面免疫檢測點表達變化

CD4+T淋巴細胞表面PD-1表達明顯上調(diào)，PDL1表達明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CTLA-4、LAG-3、CCR-4和CD137表達整體變化不顯著（P＞0.05，圖2）。

2.5 CD8+T細胞表面免疫檢測點表達變化

CD8+T淋巴細胞表面PD-1、CTLA-4和CCR-4表達上調(diào)，PD-L1表達水平下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CD137整體表達無顯著性差異（P＞0.05，圖3）。

2.6 細胞因子變化趨勢

外周血相關(guān)細胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-17A）整體表達無顯著性差異（P＞0.05，圖4）。

表2 多個周期的化療前外周血常規(guī)變化趨勢Table 2 Changes in peripheral blood routine in the pretreatment of chemotherapeutic treatment

表3 多個周期的化療前外周血生化指標變化Table 3 Statistical analysis of peripheral blood biochemical changes in the pretreatment of chemotherapeutic treatment

圖1 淋巴細胞亞群的變化趨勢Figure 1 Variation in lymphocyte subgroups

圖2 CD4+T淋巴細胞表面相關(guān)免疫檢查點變化趨勢Figure 2 Expression of immune checkpoints in CD4+T cell surface

圖3 CD8+T淋巴細胞表面相關(guān)免疫檢查點變化趨勢Figure 3 Expression of immune checkpoints in CD8+T cell surface

圖4 細胞因子變化趨勢Figure 4 Changes in cytokines

3 討論

3.1 外周血常規(guī)、生化指標變化趨勢

隨著化療，白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、血小板、血紅蛋白水平顯著下降，提示骨髓抑制作用逐漸增強，且不能恢復(fù)到同比化療之前水平，與現(xiàn)有臨床研究結(jié)果相符［9］。治療中監(jiān)測血常規(guī)變化，有助于評估骨髓再生功能，選擇合適治療時機。血生化影響不顯著，提示無肝腎基礎(chǔ)疾病患者，應(yīng)用目前化療方案對于肝腎功能相對安全。

3.2 肺癌患者多次化療中外周血淋巴細胞亞群變化趨勢

化療藥物對免疫細胞的殺傷作用，可造成免疫細胞比例和數(shù)量異常，改變機體免疫格局［4］。本研究采取每個周期化療前采血，排除化療藥物對免疫細胞的一過性殺傷作用。動態(tài)觀察5個周期（約120 d）的治療過程發(fā)現(xiàn)，肺癌患者化療中機體免疫細胞數(shù)量變化體現(xiàn)在CD8+T細胞、CD19+B細胞和CD16+CD56+NK細胞水平下調(diào)，而CD4+T淋巴細胞水平整體增加。CD8+T細胞是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細胞［10］，其水平下調(diào)提示化療過程中，機體抗腫瘤免疫處于逐漸受抑狀態(tài)；CD4+T細胞又稱為輔助性T細胞，其具有輔助免疫功能，亦可誘導(dǎo)分化Treg細胞負性調(diào)節(jié)免疫，對機體免疫調(diào)節(jié)具有雙向作用［11］，進一步細分CD4+T細胞亞型數(shù)量變化，特別是Treg細胞變化趨勢，有助于更準確地評估機體免疫功能走勢。CD19+B細胞是體液免疫的主要效應(yīng)細胞，可作為抗原提呈細胞呈遞抗原、分泌抗腫瘤抗體及相關(guān)細胞因子等途徑正向調(diào)控抗腫瘤免疫應(yīng)答［12］，其數(shù)量下降是機體整體免疫應(yīng)答不充分的一種表現(xiàn)。NK細胞又稱為自然殺傷細胞，通過直接殺傷及分泌多種細胞因子來發(fā)揮作用，是抗腫瘤免疫的第一道防線［13］，CD16+CD56+NK細胞水平整體呈下調(diào)趨勢，提示機體固有免疫功能缺失。化療過程中，對不同免疫細胞亞群的變化監(jiān)測有助于評估機體免疫功能狀況，更有針對性地選擇應(yīng)用化療及免疫治療。同時，免疫細胞數(shù)量的減少與機體抗腫瘤免疫無能密切相關(guān)。在治療過程中，通過檢測特定免疫細胞缺失情況，針對性外源性補足抗腫瘤免疫所需免疫細胞，可能獲得在化療基礎(chǔ)上更優(yōu)的治療效果。

3.3 外周血T淋巴細胞表面檢測點表達變化

T淋巴細胞作為抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細胞，其表面的共抑制或共刺激分子提供的共信號，決定了T細胞免疫應(yīng)答的最終效應(yīng)［14］。隨治療過程進展，CD4+T細胞表面PD-1表達上調(diào)，CD8+T細胞表面PD-1、CTLA-4和CCR-4表達上調(diào)，提示免疫調(diào)控負向傾斜。且在T細胞介導(dǎo)免疫逃逸過程中，CD8+T細胞可能比CD4+T細胞起到更為重要的作用。PD-L1作為與PD-1結(jié)合的主要配體，可高表達于多種腫瘤組織，通過與PD-1的結(jié)合，介導(dǎo)腫瘤細胞免疫逃逸［15］。CD4+、CD8+T細胞表面的PD-L1表達下調(diào)，有研究報道，T細胞表面PD-L1的高表達與NSCLC應(yīng)用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的療效呈負相關(guān)［16］，推測T細胞表面PD-L1的動態(tài)變化，可能也是一種反映機體T細胞免疫調(diào)控的指標。然而，T細胞表面PD-L1表達與腫瘤細胞表面PD-L1表達是否相關(guān)，呈哪種相關(guān)關(guān)系，需要同時檢測相應(yīng)時段腫瘤局部組織或浸潤細胞表面PD-L1的表達情況。下一步通過動物實驗，進行T細胞表面PD-L1的表達與腫瘤組織細胞表面PD-L1表達相關(guān)性分析，有可能提供一種實時動態(tài)監(jiān)測機體PD-1/PD-L1信號通路變化的可行思路。

研究結(jié)果顯示，在化學(xué)藥物一線治療肺惡性腫瘤細胞過程中，實施協(xié)同共抑制分子PD-1/PD-L1、CTLA-4和CCR-4監(jiān)測具有重要意義，在化療周期中，針對免疫檢查點高表達的患者，聯(lián)合應(yīng)用PD-1、PD-L1、CTLA-4或CCR-4抗體可能具有在化療基礎(chǔ)上更優(yōu)的治療效果。

3.4 肺癌患者多個周期化療中外周血細胞因子表達變化

本研究顯示，外周血相關(guān)細胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-17A）整體表達無顯著性差異?？紤]可能與不同腫瘤的不同發(fā)展階段、人體免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性以及入組對象、細胞因子測量等差異相關(guān)，提示外周血細胞因子檢測可能缺乏特異性。鑒于細胞因子的多向性行為特征，獲取腫瘤局部裂解液進行細胞因子檢測能更為準確反映腫瘤微環(huán)境的變化。

綜上所述，本研究通過監(jiān)測臨床肺癌患者多個周期化療過程中相關(guān)免疫指標的變化，提示實施淋巴細胞亞群數(shù)量及T細胞表面共抑制分子監(jiān)測具有重要意義，化療中后期針對免疫檢查點高表達患者，聯(lián)合應(yīng)用PD-1、PD-L1、CTLA-4或CCR-4抗體可能具有在更優(yōu)的治療效果。盡管標本量相對局限，結(jié)論亟需大規(guī)模的臨床論證，但相關(guān)結(jié)果亦可為將來的肺癌臨床免疫治療提供試驗依據(jù)，具有一定的臨床參考價值。

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Profiling the dynamic changes of PBMC immune-related indicators in patients with lung cancer after chemotherapy cycles

Duo YOU1,2,Yanan CHEN1,Ru YANG1,Zhishan XU1,Ping LU2,Genshen ZHONG1

1Lab of Cancer Biotherapy;2Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Weihui 453100,China

Genshen ZHONG;E-mail:zhonggs@xxmu.edu.cn

Objective:To explore the optimal time point for combining chemotherapy and immunotherapy and provide an experimental basis for immunotherapy intervention in clinical.Methods:Twenty-three lung cancer patients who completed five chemotherapy cycles between November 2015 and December 2016 in the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University were enrolled in this study.Numbers of T lymphocyte subsets,B lymphocytes,and NK lymphocytes in peripheral blood were counted.Expression levels of T lymphocyte co-suppression molecule and cytokines in the peripheral blood mononuclear cell were detected using flow cytometry to analyze the dynamic changes of such indicators from one cycle to five cycles of chemotherapy.Results:Significant decreases in the levels of CD8+T lymphocytes,CD19+B lymphocytes,and CD16+CD56+NK cells and an increase in CD4+T lymphocytes were observed in the course of multi-cycle chemotherapy for patients with lung cancer.Differences were statistically significant(P＜0.05).The co-suppression molecular expression of PD-1,CTLA-4,and CCR-4 with T lymphocytes was downregulated,and the differences were significant(P＜0.05).Conclusion:Profiling the dynamic changes of lymphocyte subsets and the expression of T lymphocyte co-suppression molecule are significant in multiple chemotherapy cycles for patients with lung cancer.In the later stage,the combined application of PD-1,PDL1,CTLA-4,or CCR-4 antibody may exert good therapeutic effects for patients with a high expression level of related immune checkpoints.

immunotherapy,T lymphocyte surface co-signaling molecules,lung cancer,multi-cycle chemotherapy

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.22.642

①新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生物治療實驗室（河南省衛(wèi)輝市453100）；②新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤二科

*本文課題受國家自然科學(xué)青年基金項目（編號：81201765）、河南省高校重點科研項目（編號：15A320063）、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新支持計劃項目（編號：YJSCX201509Z）和河南省骨干青年教師培養(yǎng)計劃項目（編號：2016GGJS-105）資助

鐘根深 zhonggs@xxmu.edu.cn

This study was supported by the National Natural Science Foundation for Youth of China(No.81201765),the Key Scientific Research Projects for Higher Education of Henan Province(No.15A320063),and the Graduate Student Support of Scientific Research Innovation Projects of Xinxiang Medical University(No.YJSCX201509Z)and Young Backbone Teachers Fellowship in Henan Province(2016GGJS-105)

（2017-06-07收稿）

（2017-08-29修回）

尤朵 專業(yè)方向為消化道和胸部腫瘤的內(nèi)科綜合治療。

E-mail：870332870@qq.com